|
|
Biotechnologická produkce PHA pomocí vybraných bakteriálních isolátů
Matějka, Filip ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce pojednává o produkci polyhydroxyalkanoátů (PHA) za využití termofilních bakteriálních izolátů s označením 34, 35 a BŽ. Bakteriální mikroorganismy pocházejí z aktivovaného kalu a kompostu. Teoretická část práce obsahuje popis PHA, extremofilních bakterií a detekčních technik pro stanovení polyhydroxyalkanoátů. V experimentální části byla nejprve pomocí PCR stanovena přítomnost phaC genu, který je klíčový pro schopnost produkce PHA a bakteriální kmeny byly také podrobeny sekvenaci genu 16S rRNA za účelem jejich taxonomické klasifikace. V další části experimentální práce došlo k optimalizaci podmínek pro nárůst biomasy a produkci PHA. Postupně byly identifikovány vhodného zdroje uhlíku, ideální kultivační teplota a taktéž byl sledován vliv prekurzorů na produkci kopolymerů. Složení a podíl PHA byl stanoven pomocí GC-FID a na závěr proběhl vizuální screening akumulace PHA uvnitř bakteriálních buněk za pomocí fluorescenční mikroskopie.
|
|
|
Utilization of physicochemical and spectroscopic techniques in study of stress-response of cyanobacteria
Skoryk, Maksym ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor's thesis focuses on observation of cyanobacteria exposed to osmotic-up and down stresses. Based on literature review appropriate methods have been proposed to study two model organisms - Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis sp. salina Wislouch CCALA 192. Four methods have been utilized to characterize osmotically stressed cyanobacteria. Flow cytometry has been utilized to assess viability of bacteria. SYTOX Blue fluorescent stain provided reliable information on bacteria stress resistance, whilst when stained with propidium iodide obscured results were obtained. Optical properties of cyanobacteria have been characterized with UV-VIS absorbance and turbidity measurements. Bacteria have undergone thermogravimetric analysis upon stress exposure to estimate cell volume dependence on extent of salt stress. This analysis suggested that PHB-positive Synechocystis sp. PCC 6803 tend to be more endurable to osmotic up-stress than PHB-negative. Gas chromatography showed PHB-positive cells to contain 1-2 % of PHB per dry cell mass.
|
|
|
Analysis of C. necator genome changes after evolutionary adaptation
Vojsovič, Matúš ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The p53 protein is a transcription factor that belongs to the group of the tumour suppressor proteins. p53 functions include cell cycle regulation, interaction with DNA, and responses to damaged DNA that may lead to apoptosis or even senescence may occur. The theoretical part summarizes the latest information about the chemical structure and functions of the protein p53 and allosteric modifications that the p53 protein may possess in cells. It also describes selected methods of isolation and characterizes proteins. The aim of the experimental part was to isolate and characterize -isoforms of the p53 protein, which were isolated from the microorganism E.coli. Protein production was preceded by preparation and transformation of plasmids into production cells. From the production cells, 4 -isoforms of p53 were isolated by affinity chromatography, due to the polyhistidine anchor that the proteins contain. The isolated proteins were subsequently characterized by SDS-PAGE and western blotting. Moreover, the transactivation potential in the yeast system was monitored by luciferase assay under conditions involving the use of various culture media, as well as expressed or coexpressed under the inducible GAL1 promoter and the constitutive GPD promoter.
|
|
|
Studium exprese genů u bakterie Cupriavidus necator a dalších vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů
Centnerová, Radmila ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá studiem exprese genů bakterie Cupriavidus necator H16, která je známa jako modelový organismus metabolismu polyhydroxyalkanoátů. V první části této práce byla provedena optimalizace metodiky RT-qPCR, jež byla posléze použita pro studium genové exprese. Dále byly porovnávány různé komerční kity pro izolaci genomické DNA, izolaci RNA, a pro reverzní transkripci a vznik komplementární DNA. Z dostupných kitů byl vybrán ten, se kterým bylo dosaženo nejrelevantnějších výsledků a zároveň byla snadná a bezpečná práce. Při izolaci bylo dosaženo rozdílných výtěžků pro jednotlivé kity, použitý kit má tak velmi významný vliv na kvalitu získané nukleové kyseliny a tím i na úspěšnost celého měření. Izolovaná genomická DNA byla použita pro účely optimalizace a kalibrace. Izolovaná RNA a komplementární DNA byly použity ve druhé části práce, ve které byla studovaná bakterie kultivována na různých uhlíkatých substrátech. Poté bylo pomocí optimalizované RT-qPCR metodiky provedeno studium exprese vybraných genů zapojených do biosyntézy polyhydroxyalkanoátů. Významnější změny v genové expresi byly obecně zaznamenány tehdy, když byla jako uhlíkatý substrát použita fruktóza oproti tomu, když byl použit -butyrolakton. Největší nárůst exprese genů byl při kultivaci na fruktóze zaznamenán pro gen, kterým je kódována 4-hydroxyfenylacetát-3-hydroxyláza. Při kultivaci na -butyrolaktonu byly významnější změny v expresi pozorovány pouze pro gen kódující 4-hydroxybutyrát dehydrogenázu. Výběr substrátu má tedy zásadní vliv na genovou expresi.
|
|
|
Využití kvasinkového isogenního systému pro studium interakcí proteinu IFI16 s DNA
Kratochvilová, Libuše ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovaného proteinu 16 (IFI16) k sekundárním lokálním strukturám G-kvadruplexu (G4) a jeho mutacím v jednohybridním kvasinkovém systému (Y1H). Protein IFI16 v buňce rozpoznává vlastní a cizorodou nebo poškozenou DNA, podílí se na tvorbě inflamazomu a indukuje expresi interferonu typu I (IFN-I). Rovněž má podíl na regulaci transkripce a restrikci virové infekce. Bylo prokázáno, že protein IFI16 se preferenčně váže ke strukturám G-kvadruplexů a je schopen je touto vazbou stabilizovat. G-kvadruplexy jsou řazeny mezi nekanonické struktury DNA a RNA tvořené sekvencemi bohaté na G. Snadno jsou tvořeny za fyziologických podmínek a nachází se v řadě významných regulačních strukturách genomu jako jsou telomery nebo promotory onkogenů. Jsou také součástí řady virových genomů. To z nich dělá vynikající potenciální cíle při léčbě nádorových a virových onemocnění. V první experimentální části práce byly připraveny nové reportérové kmeny kvasinek S. cerevisiae metodou Delitto Perfetto, které se lišily pouze v sekvenci s potenciálem tvorby G-kvadruplexu, které byly navrženy a analyzovány programem DNA Analyser. Správnost vkládaných sekvencí byla ověřena PCR a Sangerovým sekvenováním a srovnáním s dodanými sekvencemi oligonukleotidů programem Blast. V druhé části práce byly nově připravené kmeny transformovány vektory pro expresi proteinů p53, IFI16 a posuzován vliv vazby IFI16-G4 na expresi reportérového genu ve spojitosti s nádorovým supresorem p53 s využitím luciferázových reportérových testů. Vyhodnocení proběhlo na základě statistické analýzy velikostí účinků získaných po normalizování signálu luminescence na optickou hustotu kultury při vlnové délce 600 nm. Ze získaných výsledků vyplývá, že protein IFI16 má různý vliv na trans-aktivační potenciál nádorového supresoru p53 v závislosti na vazbě k vznikajícím strukturám v blízkosti promotoru genu, a že k úspěšnému vytvoření G-kvadruplexu bylo třeba dosáhnout prahové hodnoty G4Hunteru skóre alespoň 1,591 a zohlednit potenciál dané sekvence formovat úspěšně alespoň 2 G-tetrády.
|
|
|
Sekvence tvořící G-kvadruplexy v lidském genu a jeho homolozích pro amyloid beta prekursor
Stránská, Anna ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
APP gen kóduje transmembránový protein amyloid beta prekursor, který je exprimován v mnoha typech buněk, včetně neuronů. Jeho funkce nebyly zatím zcela popsány, je ale zřejmé, že u něj probíhá štěpení před exportem do extracelulárního prostoru. Dochází k jeho degradaci po různých rozkladných drahách a homodimerizaci, při které mohou vzniknout částice s protektivní funkcí neuronů stejně tak jako fragmenty, které jsou toxické a způsobují smrt nervových buněk. Vznik škodlivých amyloidních beta plaků a jejich hromadění mezi neurony v mozku je úzce spjato se vznikem a postupem Alzheimerovy choroby, neurodegenerativního onemocnění mozku projevujícího se smrtí a ztrátou neuronů, která vede k nástupu demence, tedy ztráty kognitivních funkcí. V současné době existuje mnoho výzkumů, které se zabývají souvislostmi mezi neurodegenerativními onemocněními a výskytem G-kvadruplexů v genech, které jsou zapojeny do projevů nemocí. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární struktury nukleových kyselin DNA a RNA, které vznikají v oblastech bohatých na guanin. Jsou významné především z hlediska jejich spojitosti s biologickými procesy jako je regulace genové exprese v genech a převážně v onkogenech, protože se vyskytují ve významných oblastech genu jako je promotor. Je možné je stabilizovat malými molekulami, a právě této schopnosti je využíváno ve výzkumu terapeutické léčby různých onemocnění. Ke zjištění důležitosti vyplývající z lokalizace a konzervovanosti G-kvadruplexů vyskytujících se v lidském APP genu, byla provedena bioinformatická analýza jak genu člověka, tak 346 dalších genových homologů. Pro tento účel byl použit program G4Hunter, který poskytl informace o nalezených sekvencích s potenciálem tvořit G-kvadruplex, jako je jejich umístění či G4Hunter skóre. Dále byla provedena in vitro analýza pomocí činidla thioflavin T, která otestovala schopnost nalezených sekvencí tvořit G-kvadruplexy za fyziologických podmínek. Výsledky potvrdily přítomnost a evoluční důležitost G-kvadruplexů nalezených v APP genu Homo sapiens a jejich schopnost skládat se v přítomnosti solí jako je sodík a draslík do kvadruplexních struktur.
|
|
|
Přítomnost a lokalizace lokálních DNA struktur v genomu Schizosaccharomyces pombe
Kubínová, Michaela ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Práce se zaměřuje na analýzu lokálních struktur DNA (křížových struktur a kvadruplexových struktur) v genomu Schizosaccharomyces pombe - kvasinky významné v potravinářském průmyslu. Přítomnost těchto struktur v DNA není náhodná. Na základě dříve provedených studií bylo zjištěno, že často kolokalizují s regulačními oblastmi genů a že úloha těchto sekundárních struktur v regulaci základních buněčných procesů (například replikaci či transkripci) je významná. Tato analýza byla provedena pomocí specializovaných bioinformatických nástrojů (G4Hunteru a Palindrome Analyseru), které mi umožnily tyto struktury identifikovat a následně analyzovat z hlediska jejich výskytu a lokalizace. V mtDNA bylo nalezeno mnohonásobně méně IR ve srovnání s výskytem IR v chromozomech. Bylo také zjištěno, že počet i frekvence PQS v mtDNA je velmi nízká. Od kvasinky S. cerevisiae se v tomto ohledu velmi liší. Dále bylo zjištěno, že počet nalezených IR se snižuje s rostoucí délkou IR a asi 17% IR nemá smyčku. Velké obohacení IR bylo zaznamenáno v oblasti repeat_region a rRNA, v případě PQS v oblasti rRNA a mRNA, tedy v sekvencích důležitých pro biologické procesy buňky.
|
|
|
Sekvence tvořící G-kvadruplexy v lidském genu a jeho homolozích pro amyloid beta prekursor
Stránská, Anna ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
APP gen kóduje transmembránový protein amyloid beta prekursor, který je exprimován v mnoha typech buněk, včetně neuronů. Jeho funkce nebyly zatím zcela popsány, je ale zřejmé, že u něj probíhá štěpení před exportem do extracelulárního prostoru. Dochází k jeho degradaci po různých rozkladných drahách a homodimerizaci, při které mohou vzniknout částice s protektivní funkcí neuronů stejně tak jako fragmenty, které jsou toxické a způsobují smrt nervových buněk. Vznik škodlivých amyloidních beta plaků a jejich hromadění mezi neurony v mozku je úzce spjato se vznikem a postupem Alzheimerovy choroby, neurodegenerativního onemocnění mozku projevujícího se smrtí a ztrátou neuronů, která vede k nástupu demence, tedy ztráty kognitivních funkcí. V současné době existuje mnoho výzkumů, které se zabývají souvislostmi mezi neurodegenerativními onemocněními a výskytem G-kvadruplexů v genech, které jsou zapojeny do projevů nemocí. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární struktury nukleových kyselin DNA a RNA, které vznikají v oblastech bohatých na guanin. Jsou významné především z hlediska jejich spojitosti s biologickými procesy jako je regulace genové exprese v genech a převážně v onkogenech, protože se vyskytují ve významných oblastech genu jako je promotor. Je možné je stabilizovat malými molekulami, a právě této schopnosti je využíváno ve výzkumu terapeutické léčby různých onemocnění. Ke zjištění důležitosti vyplývající z lokalizace a konzervovanosti G-kvadruplexů vyskytujících se v lidském APP genu, byla provedena bioinformatická analýza jak genu člověka, tak 346 dalších genových homologů. Pro tento účel byl použit program G4Hunter, který poskytl informace o nalezených sekvencích s potenciálem tvořit G-kvadruplex, jako je jejich umístění či G4Hunter skóre. Dále byla provedena in vitro analýza pomocí činidla thioflavin T, která otestovala schopnost nalezených sekvencí tvořit G-kvadruplexy za fyziologických podmínek. Výsledky potvrdily přítomnost a evoluční důležitost G-kvadruplexů nalezených v APP genu Homo sapiens a jejich schopnost skládat se v přítomnosti solí jako je sodík a draslík do kvadruplexních struktur.
|
|
|
Studium exprese genů u bakterie Cupriavidus necator a dalších vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů
Centnerová, Radmila ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá studiem exprese genů bakterie Cupriavidus necator H16, která je známa jako modelový organismus metabolismu polyhydroxyalkanoátů. V první části této práce byla provedena optimalizace metodiky RT-qPCR, jež byla posléze použita pro studium genové exprese. Dále byly porovnávány různé komerční kity pro izolaci genomické DNA, izolaci RNA, a pro reverzní transkripci a vznik komplementární DNA. Z dostupných kitů byl vybrán ten, se kterým bylo dosaženo nejrelevantnějších výsledků a zároveň byla snadná a bezpečná práce. Při izolaci bylo dosaženo rozdílných výtěžků pro jednotlivé kity, použitý kit má tak velmi významný vliv na kvalitu získané nukleové kyseliny a tím i na úspěšnost celého měření. Izolovaná genomická DNA byla použita pro účely optimalizace a kalibrace. Izolovaná RNA a komplementární DNA byly použity ve druhé části práce, ve které byla studovaná bakterie kultivována na různých uhlíkatých substrátech. Poté bylo pomocí optimalizované RT-qPCR metodiky provedeno studium exprese vybraných genů zapojených do biosyntézy polyhydroxyalkanoátů. Významnější změny v genové expresi byly obecně zaznamenány tehdy, když byla jako uhlíkatý substrát použita fruktóza oproti tomu, když byl použit -butyrolakton. Největší nárůst exprese genů byl při kultivaci na fruktóze zaznamenán pro gen, kterým je kódována 4-hydroxyfenylacetát-3-hydroxyláza. Při kultivaci na -butyrolaktonu byly významnější změny v expresi pozorovány pouze pro gen kódující 4-hydroxybutyrát dehydrogenázu. Výběr substrátu má tedy zásadní vliv na genovou expresi.
|
|
|
Využití kvasinkového isogenního systému pro studium interakcí proteinu IFI16 s DNA
Kratochvilová, Libuše ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovaného proteinu 16 (IFI16) k sekundárním lokálním strukturám G-kvadruplexu (G4) a jeho mutacím v jednohybridním kvasinkovém systému (Y1H). Protein IFI16 v buňce rozpoznává vlastní a cizorodou nebo poškozenou DNA, podílí se na tvorbě inflamazomu a indukuje expresi interferonu typu I (IFN-I). Rovněž má podíl na regulaci transkripce a restrikci virové infekce. Bylo prokázáno, že protein IFI16 se preferenčně váže ke strukturám G-kvadruplexů a je schopen je touto vazbou stabilizovat. G-kvadruplexy jsou řazeny mezi nekanonické struktury DNA a RNA tvořené sekvencemi bohaté na G. Snadno jsou tvořeny za fyziologických podmínek a nachází se v řadě významných regulačních strukturách genomu jako jsou telomery nebo promotory onkogenů. Jsou také součástí řady virových genomů. To z nich dělá vynikající potenciální cíle při léčbě nádorových a virových onemocnění. V první experimentální části práce byly připraveny nové reportérové kmeny kvasinek S. cerevisiae metodou Delitto Perfetto, které se lišily pouze v sekvenci s potenciálem tvorby G-kvadruplexu, které byly navrženy a analyzovány programem DNA Analyser. Správnost vkládaných sekvencí byla ověřena PCR a Sangerovým sekvenováním a srovnáním s dodanými sekvencemi oligonukleotidů programem Blast. V druhé části práce byly nově připravené kmeny transformovány vektory pro expresi proteinů p53, IFI16 a posuzován vliv vazby IFI16-G4 na expresi reportérového genu ve spojitosti s nádorovým supresorem p53 s využitím luciferázových reportérových testů. Vyhodnocení proběhlo na základě statistické analýzy velikostí účinků získaných po normalizování signálu luminescence na optickou hustotu kultury při vlnové délce 600 nm. Ze získaných výsledků vyplývá, že protein IFI16 má různý vliv na trans-aktivační potenciál nádorového supresoru p53 v závislosti na vazbě k vznikajícím strukturám v blízkosti promotoru genu, a že k úspěšnému vytvoření G-kvadruplexu bylo třeba dosáhnout prahové hodnoty G4Hunteru skóre alespoň 1,591 a zohlednit potenciál dané sekvence formovat úspěšně alespoň 2 G-tetrády.
|
host ::
RSS.