|
|
Interakce polyomavirových struktur v endoplasmatickém retikulu a na cestě do jádra
Svobodová, Terezie ; Huerfano Meneses, Sandra (vedoucí práce) ; Weber, Jan (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je modelový virus čeledi Polyomaviridae. Aby mohlo dojít k infekci buňky a replikaci viru, musí být virový genom transportován do buněčného jádra. Řada studií nasvědčuje tomu, že viriony jsou transportovány do endoplasmatického retikula, odkud jsou za účasti hostitelských proteinů přeneseny do cytosolu. Mezi takové proteiny patří chaperon BiP (protein vázající imunoglobulin) a kochaperon DNAJ B14. Polyomaviry do jádra pravděpodobně vstupují jaderným pórem za účasti importinů. Tyto procesy byly zatím studovány hlavně při infekci polyomavirem SV40. V této práci ukazujeme, že infekce MPyV vede ke změně lokalizace proteinu DNAJ B14, který se shlukuje do "foci" ve kterých kolokalizuje s virovým kapsidovým proteinem VP1. Výskyt "foci" se během infekce mění. Metodou "proximity ligation assay" jsme ukázali, že DNAJ B14 a BiP se během časné infekce dostávají do bezprostřední blízkosti VP1. Bylo postulováno, že pro cílení virionů k proteinům asociovaným s ERAD a s translokonem jsou důležité záporně nabité aminkyseliny na N-konci minoritního virového proteinu VP2. Vytvořili jsme mutanty MPyV mutované v těchto aminokyselinách. Záporně nabitá aminokyselina v pozici 17 není nezbytná pro úspěšnou infektivitu MPyV. Roli kyselých aminokyselin v pozici 10 a 13 bude nutné dále ověřit. Kromě...
|
|
|
MikroRNA kódované polyomaviry.
Zachovalová, Veronika ; Bruštíková, Kateřina (vedoucí práce) ; Malík, Radek (oponent)
MicroRNA jsou malé regulační molekuly RNA kódované v genomu organismu. Biogeneze mikroRNA probíhá částečně v jádře a částečně v cytoplazmě. Výsledkem je funkční, 22 nt dlouhá molekula mikroRNA. MikroRNA jsou schopné umlčovat geny za pomoci sekvenčně specifické degradace cílové mRNA, nebo za pomoci represe translace cílových, komplementárních mRNA. U savců je běžnější mechanismus represe translace, kdy je mikroRNA neúplně komplementární k 3'UTR cílové mRNA. Polyomaviry jsou malé, neobalené DNA viry s cirkulárním dsDNA genomem a ikosahedrální kapsidou tvořenou pentamerami VP1 proteinu. Tyto viry se řadí mezi tzv. onkogenní viry, neboť mohou přispět k transformaci buněk a rozvoji vážných onemocnění jako je například karcinom Merkelových buněk. Ve svém genomu kódují regulační proteiny nazývané T antigeny, strukturní geny kapsidy, ale také mikroRNA. Právě na mikroRNA kódované genomem SV40, MPyV, MCPyV, BKPyV a JCPyV bude zaměřená tato práce. Klíčová slova: polyomaviry, malé interferující RNA, mikroRNA, siRNA, RNA interference, myší polyomavirus, BK virus, JC virus, SV40
|
|
|
Mouse polyomavirus:The way of virus translocation to the cell nucleus and sensing of viral genomes by sensors of innate immunity
Soldatova, Irina ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Pichová, Iva (oponent)
Pochopení molekulárních mechanismů jednotlivých kroků virové infekce je předpokladem pro úspěšný návrh specifických a účinných antivirotik. Polyomaviry replikující se v buněčném jádře putují od cytoplazmatické membrány v endosomech do endoplazmatického retikula (ER). Není však jasné, jak jsou jejich DNA genomy dopravovány z ER do jádra. V této práci jsme zjistili, že částečně rozložené viriony myšího polyomaviru (MPyV) interagují s importinem β1 přibližně 6 hodin po infekci. Mutace vedoucí k oslabení nebo zrušení jaderného lokalizačního signálu (NLS) kapsidových proteinů VP1 a/nebo společné signální sekvence proteinů VP2 a VP3 neovlivnilo strukturu a složení virionů, ale mělo za následek sníženou infektivitu viru (až o 80%). Viriony se tak dostávají z ER do cytosolu a do jádra jsou dopravovány přes jaderné póry. Mutační analýzy NLS jednotlivých kapsidových proteinů ukázaly, že MPyV viriony mohou využívat NLS hlavního i minoritních kapsidových proteinů v koordinaci, nebo zástupně. Jeden funkční NLS, ať už VP1 nebo VP2/VP3, se však jeví jako dostatečný pro dopravu komplexů VP1-VP2/VP3 do jádra, ačkoli žádný z těchto proteinů se do jádra nedostává samostatně. Konformace NLS daná přítomností všech tří kapsidových proteinů se zdá být důležitá pro vazbu importinů. Poznání, že částečně rozložené viriony...
|
|
|
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Horníková, Lenka
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1,...
|
|
|
Příprava a charakterizace modifikovaných virových částic odvozených od myšího polyomaviru pro přepravu genů za účelem zvýšení účinnosti transdukce
Škvára, Petr ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Sýkora, Michal (oponent)
Virové částice odvozené od myšího polyomaviru mohou být potenciálně využity pro dopravu terapeutických genů či léčiv do cílových buněk. Tato práce se zabývá přípravou a charakterizací polyomavirových částic modifikovaných pomocí peptidů, které penetrují membrány s cílem vytipovat vhodné přístupy pro zvýšení efektivity transdukce reportérového genu do lidských buněk. V práci je analyzován transdukční potenciál virových částic tvořených hlavním kapsidovým proteinem VP1 v kombinaci s minoritním kapsidovým proteinem VP2 a s modifikovaným minoritním strukturním proteinem VP3, který je fúzován s oktaargininem, peptidem LAH4 nebo transdukční doménou adenovirového proteinu VI. Tato práce současně sleduje vliv modifikace na schopnost částic enkapsidovat heterologní DNA. Na základě testování účinnosti transdukce reportérového genu pro luciferázu pomocí modifikovaných částic se ukázalo, že žádná varianta připravených částic významně nezvýšila, ale naopak snížila efektivitu transdukce reportérového genu ve srovnání s nemodifikovanými částicemi. Práce tak přispívá svými poznatky k pochopení role minoritních kapsidových proteinů polyomaviru při přenosu genů a k návrhu nových strategií pro modifikaci částic odvozených od myšího polyomaviru pro jejich využití v nanomedicíně. Klíčová slova: myší polyomavirus,...
|
|
|
Targeting of Viral Nanoparticles to CD44 via Hyaluronic Acid
Hustedová, Anna ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Hubálek Kalbáčová, Marie (oponent)
Kyselina hyaluronová (HA) je testována jako agens cílící na rakovinné buňky nadměrně exprimující CD44. Mnohé typy nanopartikulí (NPs) byly využity k povrchové modifikaci pomocí HA. Viru podobné partikule myšího polyomaviru (VLPs) jsou zajímavou skupinou NPs. Kvůli zvýšení jejich potenciálu v rámci theragnostiky, mohou být VLPs modifikovány různými cílícími agens. HA však nebyla dosud testována jako cílící agens na VLPs, proto se tato práce zaměřuje právě na toto téma. HA (~14 kDa) byla připojena na VLPs skrze bispecifickou fluorescenční sondu odvozenou od Bodipy. Aby bylo možné otestovat cílící potenciál HA na srovnatelných nevirových NPs, byly podobným způsobem modifikovány nanodiamanty. NPs modifikované HA spolu s kontrolními variantami označenými Bodipy byly testovány na interakce s MDA-MB-231 buňkami nadměrně exprimujícími CD44. Interakce NPs s buňkami skrze CD44 byla zhodnocena pomocí kompetitivní vazebné eseje, kdy neznačená HA kompetovala s NPs o HA vazebná místa na CD44. CD44 specifické interakce byly detekovány v experimentech u HA modifikovaných nanodiamantů, zatímco VLP-HA* interagovaly s buňkami méně specificky. Kontrolní VLPs s polyethylenglykolem (PEG) s buňkami téměř neinteragovaly. Výsledky naznačují, že strategie cílení pomocí HA vyžaduje optimalizaci, aby bylo možné dosáhnout...
|
|
|
Study of exosomes in polyomavirus infection
Hyka, Lukáš ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Exosomy jsou extracelulární váčky endosomálního původu. Původně se myslelo, že exosomy slouží pouze k vylučování buněčného odpadu, avšak se ukázalo, že slouží i ke komunikaci mezi buňkami a hrají roli i ve virových infekcích. Exosomy jsou využívány viry např. k přenosu virového proteinu či jejich RNA/DNA. Jedním z virů, u kterého není role exosomů při infekci objasněna je myší polyomavirus. Myší polyomavirus patří do čeledi Polyomaviridae, do které spadá i řada lidských virů, jako je např. JC virus či virus Merkelova karcinomu. Myší polyomavirus kóduje malý, velký a střední T antigen a tři kapsidové proteiny. O středním T antigenu je známo, že se váže na buněčné membrány. Vzhledem k tomu, že exosomy jsou membránově odvozené struktury, zaměřili jsme se možný přenos středního T antigenu. K tomuto cíli bylo potřeba nejdříve zvládnout metody izolace exosomů a jejich charakterizace. Exosomy byly izolovány pomocí ultracentrifugace a dále purifikovány na hustotním gradientu OptiPrep. Charakterizovány byly pomocí elektronové mikroskopie, přístroje NanoSight a proteinových exosomových markerů. Mezi tyto markery patří například Alix, či flotillin-1. Dále byly buňky transfekovány, aby exprimovali střední T antigen. Bylo ukázáno, že exosomy izolované z těchto buněk skutečně obsahovali střední T antigen....
|
|
|
Analýza postranslačních modifikací proteinů hmotnostní spektrometrií
Musil, Dominik ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Viry, původci mnoha infekčních onemocnění, jsou malé nebuněčné částice replikující se pouze v hostitelských buňkách. Předpokládá se, že za jejich infektivitu jsou zodpovědné posttranslační modifikace virových kapsidových proteinů (např. fosforylace, které jsou katalysovány kinasami hostitelských buněk). Vhodným modelem, který lze využít pro studium vztahu fosforylačního "profilu" viru a infektivity je myší polyomavirus z čeledi Polyomaviridae. Srovnáním virionů, a tedy i hlavních kapsidových proteinů VP1 divokého kmene myšího polyomaviru s virovou mutantou vytvořenou pomocí delece části genomu kódujícího regulační proteiny viru a produkovaných ve dvou různých buněčných liniích WOP a 3T6, byla zjištěna hmotnostní spektrometrií majoritní fosforylace na třech konkrétních aminokyselinách VP1. Ty jsou považovány za důležité pro správnou morfogenesi virionů a jejich schopnost infikovat hostitelské buňky. Kvalitativní zastoupení nebylo ovlivněno volbou buněčné linie. Kromě toho, v případě pozorování "dimerizace" VP1 na elektroforeogramu SDS-PAGE byla v aminokyselinové sekvenci detekována dvojitá fosforylace VP1: pThr63, pSer66 v našem experimentálním provedení in vivo. Je tedy pravděpodobné, že posttranslační modifikace, konkrétně fosforylace mohou ovlivňovat strukturní vlastnosti virových proteinů....
|
|
|
Studium interakcí hlavního strukturního proteinu polyomavirů se strukturami hostitelských buněk
Mrkáček, Michal ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Hlavní strukturní protein VP1 je produktem pozdních polyomavirových genů a jedná se o největší a zároveň také nejvíce zastoupený protein celé polyomavirové kapsidy. Vzhledem k nízké kódující kapacitě polyomavirových genomů se uvažuje, že kromě strukturní role by protein VP1 mohl mít v pozdní fázi infekčního cyklu i řadu dalších funkcí. Právě na jejich studium je tato diplomová práce zaměřena. V případě proteinu VP1 myšího polyomaviru bylo pozorováno, že je schopen vázat se na strukturu buněčných mikrotubulů. Prvním cílem této práce bylo otestovat, jestli jsou pentamery proteinu VP1 schopny této vazby i bez účasti dalších buněčných (či virových) proteinů. Na základě in vitro experimentu můžeme říci, že se protein VP1 ke struktuře mikrotubulů váže velmi neefektivně. Druhým cílem této práce bylo připravit detekční systém, který by umožnil identifikovat potenciální interakční partnery proteinu VP1 polyomaviru BK. Proto byly připraveny expresní plazmidy produkující N a C koncově značený proteinVP1, jenžměl tu vlastnost,být v transfekovanýchbuňkáchbiotinylován. Pomocínásledné afinitní chromatografie byly izolovány celé proteinové komplexy, jež tento modifikovaný protein obsahovaly. Hmotností spektrometrií byly identifikovány jednotlivé izolované proteiny a po následné analýze a filtraci dat byl sestaven seznam...
|
|
|
Studium vlastností virových kapsidových proteinů a vývoj rekombinantních vakcín a diagnostických komponent založených na umělých virových strukturách
Fraiberk, Martin ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Hubálek Kalbáčová, Marie (oponent) ; Hejnar, Jiří (oponent)
Cílem této studie bylo vytvořit systém pro snadnou produkci různých veterinárních chimérických vakcín založených na stabilních strukturách myšího polyomaviru (MPyV). Systém je určen pro antigeny, které jsou problematické z hlediska produkce nebo stability. Nejprve byly navrženy univerzální vektory pro bakulovirovou produkci chimérických, viru podobných částic (VLPs) nebo pentamer založených na hlavním kapsidovém proteinu VP1 MPyV, k jejich využití jako vakcíny proti jiným patogenům. Různé strategie použité v této studii jsou založené na: A) vystavení vybraných imunogenních epitopů na povrchu VLPs MPyV jejich inzercí do povrchové smyčky proteinu VP1, B) inzerci cizorodých peptidů a proteinů dovnitř VLPs nebo C) fúzi cizorodého proteinu nebo jeho částí s C-koncem proteinu VP1, a tedy vytvoření pentamer chimérického proteinu. Kandidátní vakcinační antigeny proti prasečímu cirkoviru typu 2 (PCV2), původci systémových chorob spojených s PCV2 (PCV2-SD), který způsobuje významné ekonomické ztráty v chovech prasat, byly připraveny pomocí zkonstruovaných vektorů. Všechny kandidátní vakcíny byly po imunizaci myší schopny indukovat produkci protilátek proti kapsidovému proteinu PCV2. Kandidátní vakcína VarC založená na fúzním kapsidovém proteinu MPyV a PCV2 dokázala indukovat produkci protilátek s nejvyšší...
|
host ::
RSS.