|
| |
|
|
Příprava mutantních forem cytochromu b5 s fotoreaktivními aminokyselinami a jejich síťování s vazebnými partnery
Landl, David ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Cytochrom b5 plní funkci přenašeče elektronů v klinicky významném systému oxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému). Tento systém se podílí na zvýšení hydrofility látek v první fázi biotransformace xenobiotik a na aktivaci nebo deaktivaci některých léčiv a karcinogenů. Cytochrom b5 ovlivňuje reakce katalyzované terminálními oxygenasami systému - cytochromy P450. Donory elektronů cytochromu b5 jsou NADH:cytochrom b5 reduktasa a NADPH:cytochrom P450 reduktasa Cílem této práce bylo ověřit, zda je možné pomocí metody foto-chemického zesítění fixovat transientní interakce mezi těmito proteiny. Takto získané kovalentní komplexy mohou být dále analyzovány pomocí hmotnostní spektrometrie a poskytují strukturní informace o vazebných místech proteinů. Pro účely foto-síťování byl připraven mutantní cytochrom b5 obsahující v sekvenci v pozici 41 foto-aktivovatelný analog methioninu. Protein jsme exprimovali ve 300 ml limitního média, ve kterém byl methionin nahrazen L-2-amino-5,5-azi-hexanovou kyselinou (foto-methionin), a použili k tomu auxotrofní kmen bakterií E. coli B834(DE3). Míra inkorporace nepřirozené aminokyseliny byla po 16 h exprese stanovena pomocí hmotnostní spektrometrie na přibližně 40 %. Izolací jsme získali celkem 15,4 nmol mutantního cytochromu b5 o koncentraci 76,8 µmol/l. Získaný...
|
|
|
Kooperativita v systému monooxygenas cytochromů P450 z pohledu modulace metabolismu léčiv a procesu karcinogenese
Dědič, Jan ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Systém oxidas a oxygenas se smíšenou funkcí se velkou měrou podílí na metabolismu xenobiotik a endogenních látek. Systém je složen z několika komponent: cytochromu P450, NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy (CPR), cytochromu b5 a NADH:cytochrom b5 oxidoreduktasy. Bylo prokázáno, že všechny komponenty mezi sebou vzájemně interagují a zajišťují tak chod celého systému. Kooperativita celého systému je pak závislá na mnoha faktorech, zejména pak na charakteru interakcí mezi jednotlivými komponentami. Zřejmě nejdiskutovanějšími interakcemi jsou ty mezi CPR, cytochromem b5 a cytochromem P450. Hlavním redoxním partnerem cytochromu P450 je CPR, která při transportu elektronů prochází významnou konformační změnou. Cytochrom b5 může mít jak inhibiční tak i stimulační účinky na enzymovou reakci a mechanismus jeho působení nebyl dosud plně objasněn. Cytochromy P450 však mohou interagovat i mezi sebou a vytvářet tak komplexy, jejichž existence může mít na enzymovou reakci značný vliv. U kooperativity systému však z hlediska charakteru enzymové reakce nezáleží pouze na kvantitativních jevech, jako jsou inhibice nebo stimulace. Ukazuje se, že záleží také na kvalitativních efektech, neboť bylo prokázáno, že určité změny ve vzájemných interakcích komponent mohou vést k tvorbě nežádoucích produktů, např. při...
|
|
|
Mapování protein-proteinových interakcí systému cytochromu P-450 metodami chemické modifikace a hmotnostní spektrometrie
Ječmen, Tomáš ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cytochromy P-450 (P450) náleží do superrodiny hemoproteinů a v organismu se podílejí na metabolismu široké škály látek, mezi které patří některá léčiva a karcinogeny. V systému oxygenas se smíšenou funkcí plní P450 funkci terminální oxygenasy. Nezbytnou součástí je také NADPH: cytochrom P450 reduktasa (CPR), která je zodpovědná za přenos dvou elektronů na P450 v průběhu jeho katalytického cyklu. Druhý elektron může místo CPR přenášet na P450 také cytochrom b5 (cyt b5). Pro pochopení reakčního mechanismu P450 je nezbytná znalost jeho terciární struktury. V současnosti je v naší laboratoři k dispozici homologní model cytochromu P-450 2B4 (CYP 2B4). Presentovaná diplomová práce měla za cíl označení vazebné domény CYP 2B4 pro cyt b5. Ke studiu bylo použito síťovací činidlo EDC tvořící amidickou vazbu mezi aminokyselinami s opačně nabitými bočními řetězci. Pomocí hmotnostní spektrometrie se nám podařilo nalézt pět párů kovalentně propojených aminokyselin. K ověření a ke zpřesnění modelu CYP 2B4 byla použita metoda fotoafinitního značení se sondou N-(p-azidobenzyl)-N-methyl-p-aminophenylaminu. Tato sloučenina se ligandově váže na centrální atom železa hemu. Po fotoaktivaci byl pomocí MS techniky nalezen adukt argininu 197 s fotoaktivovanou sondou. Oba presentované výsledky ukazují správnost zvolených metodických...
|
|
|
Mutageneze a exprese proteinu NKp80, aktivačního receptoru lidských lymfocytů
Pazderová, Kristýna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Předmětem této práce je receptor NKp80, také známý jako KLRF1 (z angl. killer cell lectin-like subfamily F, member 1). Je to aktivační receptor tvořící homodimery na povrchu NK buněk. Váže se na ligand AICL, který se přirozeně nachází na myeloidních buňkách. Pokud dojde k výraznému navýšení exprese ligandu AICL, např. na nádorových buňkách, stává se buňka terčem pro NK buňky, které exprimují receptor NKp80. Komplex NKp80:AICL je potenciálním cílem imunoterapeutické léčby myeloidní leukémie. Cílem práce byla produkce a purifikace extracelulární domény receptoru NKp80 a jejích variant, kde v její části tzv. "stalk" oblasti byly jednotlivé cysteiny nahrazeny seriny. Pomocí zavedených mutací zde byl sledován vliv na tvorbu homodimerů. Proteiny byly produkovány za použití stabilně transfekovaných linií buněk HEK293S GnTI-. Celkem bylo produkováno sedm mutantů se všemi možnými kombinacemi mutací tří cysteinů "stalk" oblasti. Proteiny pak byly analyzovány pomocí analytické gelové permeační chromatografie, diferenční skenovací fluorimetrie, a nakonec byla pomocí deglykosylace ověřena přítomnost více glykosylačních forem receptoru NKp80. Z výsledků je zřejmé, že u žádné varianty receptoru NKp80 nedochází ke tvorbě kovalentních homodimerů, ale z hodnoty elučního objemu proteinu můžeme předpokládat, že v...
|
|
|
Radikálové značení proteinů jako nástroj validace biologických terapeutik
Binar, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Hmotnostní spektrometrie a techniky s ní spojené jsou velice důležitým a užitečným nástrojem při studiu struktury proteinů. Jednou z těchto technik je i kovalentní značení proteinů, které je možné použít ke zkoumání přístupnosti jejich povrchu a jejich dynamiky obecně. Přestože již byla pro tuto metodu vyvinuta spousta činidel, většina z nich je limitována jejich schopností selektivně reagovat jen s omezeným počtem aminokyselin, většinou lysinem, argininem nebo tyrosinem a neselektivní metody, jako rychlá fotochemická oxidace proteinů, jsou velice náročné a nákladné. Z toho důvodu existuje stále snaha o vývoj nových metod kovalentního značení. Touto novou metodou by mohla být trifluormethylace, která je stále více používanou technikou modifikace organických molekul a jejíž možný potenciál jsme se proto rozhodli studovat. V této práci jsme použili novou skupinu formálně elektrofilních činidel, která je vytvořena na bázi cyklického hypervalentního jodidového jádra. Tato skupina tzv. Togniho činidel byla použita jako nástroj radikálového značení proteinů. Jako modelový protein byla vybrána lidská karbonická anhydrasa, jejíž struktura je velice dobře prostudována. Modifikovaný protein byl analyzován přístupem bottom up pomocí kombinace kapalinové chromatografie a tandemové hmotnostní spektrometrie s...
|
|
|
Mapování protein-proteinových interakcí systému cytochromu P-450 metodami chemické modifikace a hmotnostní spektrometrie
Ječmen, Tomáš ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce)
Mapování protein-proteinových interakcí systému cytochromu P-450 metodami chemické modifikace a hmotnostní spektrometrie Abstrakt Cytochromy P-450 (P450) náleží do superrodiny hemoproteinů a v organismu se podílejí na metabolismu široké škály látek, mezi které patří některá léčiva a karcinogeny. V systému oxygenas se smíšenou funkcí plní P450 funkci terminální oxygenasy. Nezbytnou součástí je také NADPH: cytochrom P450 reduktasa (CPR), která je zodpovědná za přenos dvou elektronů na P450 v průběhu jeho katalytického cyklu. Druhý elektron může místo CPR přenášet na P450 také cytochrom b5 (cyt b5). Pro pochopení reakčního mechanismu P450 je nezbytná znalost jeho terciární struktury. V současnosti je v naší laboratoři k dispozici homologní model cytochromu P-450 2B4 (CYP 2B4). Presentovaná diplomová práce měla za cíl označení vazebné domény CYP 2B4 pro cyt b5. Ke studiu bylo použito síťovací činidlo EDC tvořící amidickou vazbu mezi aminokyselinami s opačně nabitými bočními řetězci. Pomocí hmotnostní spektrometrie se nám podařilo nalézt pět párů kovalentně propojených aminokyselin. K ověření a ke zpřesnění modelu CYP 2B4 byla použita metoda fotoafinitního značení se sondou N-(p-azidobenzyl)-N-methyl-p-aminophenylaminu. Tato sloučenina se ligandově váže na centrální atom železa hemu. Po fotoaktivaci byl pomocí...
|
|
| |
|
|
Příprava a charakterizace polymerních, enzymově štěpitelných, nosičů kancerostatik
Zelený, Jan ; Etrych, Tomáš (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Současně s rozvojem protinádorových léčiv vyvstává stále častěji otázka, jak tato léčiva, která mnohdy sama o sobě vykazují karcinogenní účinky, s jistotou a efektivně dopravovat přímo do postižených tkání a předejít tak jejich destruktivním účinkům na zbytek organismu. Jednou z možností, jak dopravovat léčivo do nádorové tkáně, je využití některé ze specifických vlastností této tkáně, z nichž jednou je efekt zvýšené propustnosti a zádrže (tzv. EPR efekt). Tento jev, který bude v této práci dále diskutován, umožňuje makromolekulám, které jsou příliš objemné na to, aby pronikly z krevního řečiště do nepostižené tkáně, proniknout do tkáně nádorové a hromadit se v ní. Je-li tedy protinádorové léčivo připojeno k vhodné makromolekule, může díky tomuto efektu společně s ní vstoupit cíleně do nádorové tkáně. Je-li navíc toto léčivo připojeno k makromolekule prostřednistvím enzymově štěpitelné spojky, lze využít přítomnosti lysozomálních proteas (např. katepsinu B, který je v některých rakovinných buňkách zastoupen ve vyšší míře než v buňkách zdravých) k jeho odštěpení a aktivaci. Tato práce vedle samotných protinádorových léčiv popisuje jednotlivé zástupce polymerních systémů určených k směrování těchto léčiv, jejich strukturu a funkci. V části experimentální je dále popsána syntéza některých polymerních...
|
|
|
Radikálové značení proteinů jako nástroj validace biologických terapeutik
Binar, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Hmotnostní spektrometrie a techniky s ní spojené jsou velice důležitým a užitečným nástrojem při studiu struktury proteinů. Jednou z těchto technik je i kovalentní značení proteinů, které je možné použít ke zkoumání přístupnosti jejich povrchu a jejich dynamiky obecně. Přestože již byla pro tuto metodu vyvinuta spousta činidel, většina z nich je limitována jejich schopností selektivně reagovat jen s omezeným počtem aminokyselin, většinou lysinem, argininem nebo tyrosinem a neselektivní metody, jako rychlá fotochemická oxidace proteinů, jsou velice náročné a nákladné. Z toho důvodu existuje stále snaha o vývoj nových metod kovalentního značení. Touto novou metodou by mohla být trifluormethylace, která je stále více používanou technikou modifikace organických molekul a jejíž možný potenciál jsme se proto rozhodli studovat. V této práci jsme použili novou skupinu formálně elektrofilních činidel, která je vytvořena na bázi cyklického hypervalentního jodidového jádra. Tato skupina tzv. Togniho činidel byla použita jako nástroj radikálového značení proteinů. Jako modelový protein byla vybrána lidská karbonická anhydrasa, jejíž struktura je velice dobře prostudována. Modifikovaný protein byl analyzován přístupem bottom up pomocí kombinace kapalinové chromatografie a tandemové hmotnostní spektrometrie s...
|
host ::
RSS.