|
|
Study of mechanism of signal transduction in case of two model heme-containing sensor proteins
Mihalčin, Peter ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Hemové senzorové proteíny, ktoré detekujú plynné molekuly tvoria skupinu proteínov prítomných v signálnych dráhach baktérií. Precízna regulácia fyziologických funkcií ako medzibunková komunikácia či produkcia biofilmu je zásadná pre prežitie baktérií a ich adaptáciu na okolité podmienky. Hemové senzorové proteíny detekujú koncentráciu plynných molekúl v okolitom prostredí senzorovou doménou (ktorá obsahuje molekulu hemu ako vlastné detekčné miesto) a prenášajú signál na funkčnú doménu, ktorá pomáha riadiť adaptáciu fyziologických procesov. Tieto procesy často patogénneho prejavu prispievajú k rozšírenej rezistencií baktérii voči antibiotikám. Hemové senzorové proteíny sa javia ako nový terapeutický objekt v antimikrobiálnej liečbe. Za účelom realizácie tohto typu terapie je najskôr nutné pochopiť presný mechanizmus intramolekulárneho prenosu signálu hemovými senzorovými proteínmi. Jeden z prístupov ako odhaliť tieto mechanizmy je štúdium modelových signálnych proteínov. Táto diplomová práca je zameraná na výskum prenosu signálu dvoma modelovými hemoproteínmi s globínovou štruktúrou senzorovej domény, ktoré detekujú kyslík.
|
|
|
Využití hmotnostního spektrometru při aminokyselinové analýze
Matoušková, Zuzana ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Aminokyselinová analýza našla v průběhu let uplatnění napříč mnoha obory. Díky prvotnímu účelu, pro který byla vyvinuta si s sebou nese určité problémy jako je např. chybějící asparagin, glutamin a tryptofan. Existuje spoustu aplikací, ve kterých je potřeba kvantifikovat i tyto chybějící aminokyseliny. Rychlejší, ale méně citlivou alternativou by mohla být detekce pomocí hmotnostní spektrometrie, která navíc umožňuje analýzu i ostatních metabolitů a látek bez aminoskupiny. Aby byla nově vyvinutá metoda užitečná je potřeba znát její možnosti a limity. Tato práce zahrnuje jak metodu, ve které se jednotlivé aminokyseliny separují na hydrofilní interakční chromatografii a následně detekují pomocí hmotnostní spektrometrie, tak její základní charakterizaci a porovnání s dosud běžně používanou fluorescenční metodou, komerčně dostupnou od firmy Waters.
|
|
|
Multivalentní sacharidové ligandy galektinů
Hovorková, Michaela ; Křen, Vladimír (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Galektiny jsou proteiny patřící do skupiny lektinů, které jsou schopné vázat sacharidové jednotky a dokážou specificky rozeznat glykany vystavené na povrchu buněk. Galektiny se in vivo účastní např. kancerogeneze, angiogeneze či fibrózy. Jejich výskyt signifikantně stoupá v souvislosti s řadou patogenních procesů, a proto je lze využít jako markery u některých typů rakovin nebo kardiopatologií a též pro cílenou vazbu terapeutik a/ nebo zobrazovacích činidel v diagnostice a terapii. Galektin-3 má specifickou strukturu označovanou jako chimerická a je schopný tvořit multivalentní oligomery. Přirozenými ligandy galektinů jsou glykany obsahující terminální β-galaktosidy, zvláště N-acetyllaktosamin, avšak vazba monovalentních glykanů je velmi slabá. Glykokonjugáty s vysokou afinitou ke galektinovým receptorům jsou optimálně multivalentní, biokompatibilní a stabilní in vivo. Tato kritéria splňují sacharidové ligandy konjugované na rozpustné a strukturně flexibilní N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidové (HPMA) kopolymery. V rámci této práce byly pomocí enzymové syntézy připraveny dva druhy funkcionalizovaných disacharidů, založené na N-acetyllaktosaminu (Galβ4GlcNAc) a jeho strukturním analogu N,N'-diacetyllaktosaminu (GalNAcβ4GlcNAc). Pro syntézu byl použit komerční enzym β-galaktosidasa z Bacillus...
|
|
| |
|
|
Strukturní studium potkaního NK buněčného receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
NK buňky vykazují unikátní schopnost rozeznávat a způsobit smrt nádorových, či virem infikovaných buněk bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je regulována vyváženými signály indukovanými aktivačními a inhibičními povrchovými receptory při interakci s ligandy cílové buňky. To může být ilustrováno na potkaním receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb, které hrají mimo jiné zásadní roli v odpovědi NK buněk na infekci potkaním cytomegalovirem (RCMV). Během infekce RCMV cílová buňka snižuje expresi ligandu Clrb a tím snižuje inhibiční signál přenášený skrze NKR-P1B do NK buňky, to v ideálním případě vede k aktivaci NK buňky a lyzi infikované buňky. Nicméně, RCMV obsahuje gen pro falešný povrchový receptor - RCTL, který napodobuje Clrb, a tak napomáhá úniku před imunitní odpovědí NK buněk. Zatímco tato úniková strategie byla zaznamenána v kmeni potkanů WAG, ukázalo se, že NKR-P1B homolog z potkaního kmene SD váže pouze Clrb a nerozeznává RCTL. Díky tomu je SD kmen méně citlivý k infekci RCMV. Tato práce si klade za cíl poodhalit molekulární základ NKR-P1B:Clrb receptor- ligandového rozeznávání, přičemž vychází z našich dřívějších úspěšných výsledků získaných pro lidský NKR-P1:LLT1 receptor-ligandový pár. Ukázalo se, že pro následnou krystalizaci NK buněčných receptorů a jejich ligandů je...
|
|
|
Struktura a interakce lidského regulačního proteinu 14-3-3: fotoafinitní značení in vitro a hmotnostní spektrometrie.
Mazurová, Martina ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Tato diplomová práce je zaměřena na studium interakcí proteinu 14-3-3ζ, který patří mezi regulační proteiny vyskytující se ve všech eukaryotických buňkách. Význačným rysem proteinu 14-3-3 je jeho schopnost vázat řadu strukturně s funkčně odlišných proteinových ligandů. Tato vazba je většinou realizována prostřednictvím fosforylovaných serinových a threoninových motivů. Cílem této práce je příprava dostatečného množství proteinu 14-3-3ζ s inkorporovaným fotoaktivovatelným analogem methioninu (foto-Met, L-2-amino-5,5-azihexanová kyselina). Byly testovány čtyři různé podmínky rekombinantní exprese v auxotrofním kmeni E. coli B834 (DE3) pro získání proteinu s maximální inkorporací fotoaktivovatelného analogu methioninu do sekvence rekombinantního proteinu. Dalším cílem je studium míry zapojení methioninů 121, 160 a 218 ve vazebném žlábku proteinu 14-3-3ζ a případné nalezení kovalentní vazby s fosforylovaným nebo nefosforylovaným peptidem 251-266 Raf-1 kinázy (fosforylace na Ser259). Pro síťování byla použita metoda světlem iniciované reakce (fotolýza), po které z foto-Met vzniká reaktivní biradikál schopný tvorby nové kovalentní vazby s aminokyselinovými zbytky v blízkém okolí (do 5Å). Nakonec byly analyzovány produkty síťovacích reakcí pomocí MALDI-TOF MS, LC-MS a LC-MS/MS. Zvolenými postupy a...
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidské NADPH: cytochrom P450 oxidoreduktasy
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
NADPH: cytochrom P450 oxidoreduktasa (POR) je nezbytnou složkou řady metabolických procesů, kde vystupuje jako přenašeč redukčních ekvivalentů mezi NADPH a redoxním partnerem. K takovým procesům patří i katalytické reakce cytochromů P450, které se markantně podílejí na metabolismu steroidních hormonů, léčiv a xenobiotik. Obzvláště pak mikrosomální cytochromy P450 jsou striktně závislé na elektronové podpoře ze strany POR a společně vytvářejí systém oxygenas se smíšenou funkcí. Mutace v proteinové struktuře POR mohou doléhat na aktivitu jeho redoxních partnerů a některé polymorfismy POR mohou vést až k vážným poruchám, většinou spojených s defektním metabolismem steroidů. V této práci byla připravena POR nesoucí dvojí mutaci A503V a P228L. Doposud však nebylo prokázáno, že by byl tento polymorfismus asociován s jakýmkoli neobvyklým vývojovým fenotypem či poruchou, které by měly devastující účinky na lidský organismus. Nicméně při některých metabolických studiích se hodnoty aktivity A503V odlišují od hodnot stanovených pro wild-type formu POR. V rámci této diplomové práce byly připraveny konstrukty rekombinantní plasmidové DNA nesoucí gen pro lidskou POR nebo gen pro lidskou POR s histidinovou kotvou. Oba konstrukty byly založeny na expresním vektoru pCW. Rekombinantní POR bez histidinové kotvy byla...
|
|
|
Rekombinantní exprese a purifikace nitrilasy z Neurospora crassa
Zawadová, Dorota ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Nitrilasy jsou enzymy schopné transformovat toxické nitrilové sloučeniny na příslušné karboxylové kyseliny nebo amidy. Jsou proto jsou potencionálně využitelné při detoxikaci barviv, herbicidů nebo látek používaných při přípravě léčiv. Jejich dalším uplatněním může být enzymatická výroba karboxylových kyselin, u kterých je postup přípravy neenzymatickou cestou drahý nebo příliš náročný. Náplní této diplomové práce je rekombinantní exprese a optimalizace purifikace nitrilas pocházejících z vláknité houby Neurospora crassa. Jako expresní systém, do kterého byla vnesena sekvence genu kódující tento enzym, byly použity buňky E. coli BL 21 Gold. Purifikace byla provedena v redukujícím prostředí za pomoci chromatografie na iontoměniči, chelatační chromatografie a gelové filtrace. Připravené enzymy byly charakterizovány pomocí sedimentační analýzy v analytické ultracentrifuze, dále pak byly použity pro hledání podmínek krystalizace. Klíčová slova: nitrilasa, Neurospora crassa, rekombinantní exprese
|
|
|
Strukturní analýza filamentózního hemaglutininu (FhaB) z Bordetella pertussis
Jurnečka, David ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Man, Petr (oponent)
: Filamentózní hemaglutinin (FHA) je adhesivní proteinová molekula, která je uvolňována gram-negativní bakterií Bordetella pertusis, způsobující infekční onemocnění zvané černý kašel (pertuse). C-koncový segment FHA hraje klíčovou roli v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami, nicméně jeho struktura zůstává zatím neznámá. V této práci byla identifikována C-koncová aminokyselina FHA jako alanin v pozici 2304, zatímco C-koncová aminokyselina degradačního produktu FHA (FHA*) byla v pozici 2228. Spektroskopie cirkulárního dichroismu (CD) a nukleární magnetická resonance (NMR) ukázaly, že C-koncový fragment FHA (FHA 1995-2228) má alfa-šroubovicový charakter a netvoří definovanou terciární strukturu. Navíc, potlačení transkripce malé regulační RNA párující se k5' konci fhaB transkriptu vede k dvojnásobnému zvýšení produkce FHA. Ze získaných dat vyplývá, že C- koncový segment FHA má vlastnosti nestrukturovaných proteinů a produkce FHA je negativně regulována pomocí malé RNA. Klíčová slova: Bordetella pertussis, filamentózní hemaglutinin, malá RNA
|
|
|
Strukturní charakterizace interakce Nkr-p1f/Clrg
Tůmová, Lucie ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Ptáčková, Renata (oponent)
NK buňky jsou řazeny mezi lymfocyty, které se účastní primární odpovědi imunitního systému na viry infikované a nádorové buňky. Současně produkují cytokiny a zapojují se do tvorby sekundární imunitní odpovědi spolu s T a B lymfocyty. Tato diplomová práce se zabývá studiem struktury a interakce membránového receptoru Nkr-p1f spolu s ligandem Clr-g. Receptor Nkr-p1f má aktivační funkci a je schopen zahájit cytotoxickou funkci NK buněk. Trojrozměrná struktura byla vyřešena u homodimeru Clr-g, ale jeho interakce s receptorem dosud ne. Cílem práce bylo připravit produkční vektor celé extracelulární části receptoru Nkr-p1f a provést produkci Nkr-p1f a Clr-g v prokaryotickém expresním systému. Následně provést renaturaci a purifikaci proteinů in vitro. Tímto způsobem připravené proteiny byly analyzovány elektroforeticky a hmotnostní spektrometrií. Jejich interakce byla sledována biofyzikální metodou, povrchovou plasmonovou rezonancí (SPR). Avšak interakce mezi nimi nebyla technikou SPR odhalena.
|
host ::
RSS.