|
|
New functionalized nucleic acids for application in chemical biology
Kielkowski, Pavel ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent) ; Moravcová, Jitka (oponent)
5 Abstrakt Tato práce je zaměřena na syntézu modifikovaných 2'-deoxyribonukleosid trifosfátů, jejich inkorporaci do DNA a aplikaci v chemické biologii. Byla vyvinuta syntéza "douhlavých" nukleosidů a nukleosid trifosfátů, které obsahují ethynylový nebo propargylový můstkem mezi dvěmi bázemi. (Cytosin-5-yl)ethynyl, 3-(cytosin-1-yl)prop-1-yn-1-yl a 3-(5- fluorcytosin-1-yl)prop-1-yn-yl substituované pyrimidiny a 7-deazaadeniny 2'- deoxyribonukleosidů a nukleosid trifosfátů byly připraveny palladiem katalyzovanou cross- coupling reakcí ve vodném prostředí. Tyto 2'-deoxyribonukleosid trifosfáty obsahující dvě nukleobáze jsou dobrými substráty pro DNA polymerasy v primer extension reakci a PCR a tudíž vhodné pro přípravu DNA s cytosinem nebo 5-fluorcytosinem ve velkém žlábku, která tak napodobuje nukleobázi vyjmutou ven z DNA dvoušroubovice. Byla také vyzkušena metoda pro testování inhibice DNA methyltransferáz. Dále, bylo vyvinuto přechodné chránění DNA proti štěpení restrikčními endonukleázami (RE) za pomocí (trialkylsilyl)ethynyl modifikované DNA. Bylo dokázáno, že všechny připravené (trialkylsilyl)ethnyl-modifikované 7-deaza-2'-deoxyadenosin trifosfáty se inkorporují do DNA KOD XL polymerásou v primer extension reakci a nebo pomocí PCR. Podmínky potřebné pro odchránění trialkylsilylové chránicí skupiny byly...
|
|
|
Mechanismus působení protinádorových léčiv v neuroblastomech
Groh, Tomáš ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Levová, Kateřina (oponent) ; Vališ, Karel (oponent)
Nádorové buňky se obvykle dokážou dynamicky adaptovat na stresové hypoxické prostředí, které je způsobené nedokonalou vaskularizací nádoru. V disertační práci bylo zjištěno, že neuroblastomové nádorové linie UKF-NB-3 a UKF-NB-4 se na hypoxii adaptují zvýšením acetylace histonů. Zvýšená acetylace je obecně spojována s rozvolněním chromatinové struktury, a tím i s transkripční aktivací genů. Dále bylo zjištěno, že hypoxie v těchto liniích mění expresi proteinu transkripčního faktoru N-myc, který je důležitý pro vývoj neuroblastomů. Zodpovědný je i za metabolickou adaptaci, zvýšenou agresivitu a horší prognózu onemocnění. Inhibitory histondeacetylas (HDAC) jsou slibné látky s protinádorovým účinkem. Mohou indukovat zástavu buněčného cyklu, diferenciaci či programovanou buněčnou smrt v sensitivních nádorech. V práci byl studován vliv inhibitoru HDAC, valproátu, na expresi proteinů transkripčních faktorů N-myc a faktoru 1α indukovaného hypoxií (HIF-1α), důležitých pro proliferaci nádorových buněk. Testovaný inhibitor HDAC způsoboval snížení exprese obou transkripčních faktorů, což potvrzuje jeho protinádorový efekt. Protein CD133 je spojován s fenotypem kmenových nádorových buněk. V disertační práci bylo zjištěno, že zvýšená exprese proteinu CD133 po kultivaci buněk UKF-NB-3 s valproátem je spojená s...
|
|
|
Mechanismus enzymové aktivace karcinogenů a léčiv systémem cytochromů P450
Indra, Radek ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Koblihová, Jitka (oponent)
12 Abstrakt Environmentální polutant benzo[a]pyren (BaP) je prokazatelným lidským karcinogenem, který se po aktivaci cytochromy P450 (CYP) kovalentně váže na DNA. V rámci dizertační práce byl studován vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO), systému lokalizovanému v membráně endoplasmatického retikula, na metabolismus benzo[a]pyrenu a na tvorbu aduktů BaP s DNA. Zaměřili jsme se především na porovnání vlivu cyt b5 na tento metabolismus a potenciál cyt b5 sloužit jako donor elektronů v rámci reakčního cyklu cytochromu P450 1A1. Tento vliv byl studován jednak z pohledu tvorby metabolitů BaP, a jednak z pohledu tvorby jeho aduktů s DNA. Byl také studován vliv dvou expresních systémů pro cytochrom P450 1A1 (prokaryotický a eukaryotický), na jeho účinnost v metabolismu BaP. Vliv cyt b5 na účinnost monooxygenasového systému byl studován i s další cizorodou látkou, rostlinným alkaloidem ellipticinem, jenž vykazuje protinádorové účinky. Jeho protinádorový efekt, stejně jako vedlejší účinky, závisí na jeho metabolické aktivaci cytochromy P450. Významný z tohoto hlediska je zejména CYP3A4. Ten byl proto použit i v našich experimentech. Dále byla v práci studována vhodnost laboratorního potkana sloužit jako model metabolického osudu BaP v lidském organismu. Při studiu...
|
|
|
Dopad izolovaného deficitu F1FO-ATP syntázy na ostatní komplexy oxidační fosforylace v kožních fibroblastech v závislosti na podmínkách kultivace
Kedrová, Kateřina ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Poljaková, Jitka (oponent)
Izolovaný deficit F1FO-ATPsyntázy je skupinou mitochondriálních onemocnění způsobených mutacemi v jaderně- a mitochondriálně-kódovaných strukturních podjednotkách, nebo jaderně-kódovaných faktorech biogenese komplexu F1FO-ATPsyntázy. Nejčastěji jsou to mutace v genu MTATP6, nacházející se v mitochondriální DNA, a v genu TMEM70, nacházející se v jaderné DNA. Gen MTATP6 kóduje strukturní podjednotku "a" komplexu F1FO-ATPsyntázy a jeho mutace způsobuje snížené množství F1FO-ATPsyntázy a její fosforylační aktivitu. Gen TMEM70 kóduje protein vnitřní mitochondriální membrány o velikosti 21 kDa s doposud zcela neobjasněnou funkcí a jeho mutace způsobuje poruchu biogeneze komplexu F1FO-ATPsyntázy. Cílem práce bylo studovat ve dvou liniích primárních kožních fibroblastů s izolovaným deficitem F1FO-ATPsyntázy (mutace m.8851T>C v MTATP6 a mutace c.317-2A>G v TMEM70) dopad tohoto deficitu na systém oxidační fosforylace, vybrané mitochondriální proteiny a mitochondriální síť ve srovnání s kontrolní linií primárních kožních fibroblastů v prvních dnech kultivace (1-5 dní) v médiu obsahujícím jako zdroj sacharidů galaktózu nebo glukózu a v médiu s přítomnou a nepřítomnou aminokyselinou L-glutaminu. U kontrolní linie kultivované v médiu DMEM obsahujícím jako zdroj sacharidů galaktózu bylo nalezeno vyšší množství...
|
|
|
Analogy insulinu s řetězcem A prodlouženým o doménu D proteinů IGF-1 a IGF-2
Povalová, Anna ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Insulin a insulinu příbuzné růstové faktory 1 a 2 (IGF-1 a -2) tvoří spolu se svými receptory komplexní systém, který ovlivňuje jak bazální metabolismus sacharidů, lipidů a bílkovin tak i buněčný růst, proliferaci, diferenciaci a apoptózu. Poruchy v působení insulinu a faktorů IGF mohou vést k závažným onemocněním jako je cukrovka či rakovinné bujení. Obě tyto choroby v současnosti představují jedny z největších zdravotních hrozeb pro světovou populaci. Insulin i oba IGF vyvolávají své biologické efekty prostřednictvím vysoce podobných receptorů, kterými jsou dvě isoformy receptoru insulinu (IR-A a IR-B) a receptor pro IGF-1 (IGF-1R). Na tyto receptory se hormony vážou s různými afinitami a vyvolávají rozdílné, ale i částečně se překrývající efekty, ať už metabolické (převážně insulin) nebo růstové (IGF i insulin). Pro pochopení mechanismu působení insulinu a IGF je důležité porozumět, které oblasti ve struktuře hormonů jsou důležité pro vazbu na receptory a pro vyvolání specifických účinků. Jednou z oblastí, kterou se insulin a IGF výrazně liší, jsou D-domény IGF-1 a -2, které zcela chybí v insulinu. Z těchto důvodů jsme se rozhodli připravit analogy insulinu s prodlouženým řetězcem A o D-domény IGF či jejich fragmenty s cílem definovat vliv těchto domén na vazebnou specificitu vůči receptorům...
|
|
|
Tandemová hmotnostní spektrometrie sfingolipidů s aplikací pro metabolické studie a diagnostiku sfingolipidos
Kuchař, Ladislav ; Ledvinová, Jana (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent) ; Holčapek, Michal (oponent)
V posledních letech se hmotnostní spektrometrie (MS) stala dominantní technologií používanou při lipidomické analýze a silně ovlivnila výzkum a diagnostiku onemocnění lipidního metabolismu jako např. lysosomální střádavá onemocnění (LSD) charakterisovaná poruchami funkcí lysosomů. Soubor poruch lysosomální degradace sfingolipidů (SFL) přísluší ke skupině sfingolipidos. Tento stav má vážné až fatální klinické důsledky. Prvotním cílem práce bylo zavedení kvantitativní a kvalitativní analýzy SFL pro výzkum a diagnostiku LSD. Na jejím počátku bylo třeba připravit semisynthesou lipidní hmotnostně značené standardy pomocí imobilizované sfingolipid ceramid N-deacylasy. Zavedené metody kvantitativní analysy byly posléze použity k průkazu zvýšené exkrece močových SFL u LSD s charakteristickým střádáním v ledvinách. Vyhodnocení SFL vylučovaných močí prokázalo svůj význam při diferenciální diagnostice deficitu prosaposinu a saposinu B kdy rutinní enzymologie selhává. MS navíc umožňuje sledování jednotlivých molekulárních druhů SFL (isoforem), jenž vedlo ke zjištění, že u některých LSD se jejich profil v moči mění. To následně vedlo k vývoji nové screeningové metody v suchém vzorku moče založeném na vyhodnocování profilu isoforem. Další aplikací MS byla analýza pitevních vzorků tkání nebo buněk u nevyjasněných...
|
|
|
Synthesis of nucleosides, nucleotides and nucleic acids bearing bipyridine-type ligands
Kalachová, Ľubica ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent) ; Rosenberg, Ivan (oponent)
Byla vyvinuta efektivní metodika přípravy modifikovaných nukleosidů nesoucích oligopyridinové ligandy založená na Sonogashirově nebo Suzukiho reakci halogenovaných nukleosidů. Tatéž metodika byla úspěšně uplatněna při syntéze modifikované DNA nesoucí oligopyridinové ligandy za účelem studia její post-syntetické komplexace s labilními přechodnými kovy. Deoxynukleosid trifosfáty (dNTPs), syntetizované v prvním kroku a nesoucí různé skupiny chelatující kovy, byly ve druhém kroku pomocí PEX enzymaticky inkorporovány do DNA. Prvním cílem byla syntéza dNTPs nesoucích různé oligopyrinové ligandy, která může být provedena kaplinkem příslušných stavebních bloků ve vodné fázi nebo trifosforylací deoxynukleosidů modifikovaných oligopyridinem. Oba tyto přístupy byly úspěšně použity. dNTPs nesoucí oligopyridinový ligand připojený přes krátký a rigidní acetylenový můstek byly připraveny Sonogashirovým kaplinkem ve vodné fázi. Naproti tomu dNTPs modifikované oligopyridinovým ligandem napojeným dlouhou a flexibilní oktadiynovou spojkou byly syntetizovány klasickou trifosforylací. Sonogashirova reakce byl použit také pro přípravu obou typů nukleosidů (s acetylenovým i oktadiynovým můstkem), které byly použity jako modelové sloučeniny. dNTPs modifikované oligopyridinem byly testovány jako substráty několika...
|
|
|
The role of Hippo Signalling pathway in tumor cell metabolism
Lettlová, Sandra ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Analogy vitaminu E, α-tokoferyl sukcinát (α-TOS) a mitochondriálně cílený vitamin E sukcinát (MitoVES), jsou látky s protinádorovým účinkem ze skupiny "mitokanů", která se vyznačuje tím, že účinkuje prostřednictvím mitochondrií, jenž představují nadějný cíl protinádorové léčby. α-TOS a MitoVES selektivně indukují apoptózu v různých typech nádorových buněk pomocí generace reaktivních forem kyslíku (ROS). Generovaný superoxidový anion radikál je přeměněn na peroxid vodíku, který je znám jako aktivátor "Mammalian sterile 20-like kinase" (Mst1). Mst1-kináza je součástí signalizační dráhy Hippo, která představuje mechanismus zodpovědný za správný vývoj a velikost orgánů u mnohobuněčných organismů a její deregulace je spojena s vývojem nádorového onemocnění. α-TOS a MitoVES aktivují Mst1-kinázu, která dále fosforyluje transkripční faktor "Forkhead box O1" (FoxO1), což vede k jeho transportu do jádra, kde aktivuje expresi pro-apoptotických genů, mezi nimiž je i gen pro "Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1" (NOXA), a tím indukuje apoptózu. Cílem signalizační dráhy Hippo je transkripční ko-aktivátor "Yes-associated protein" (Yap), jenž u Drosophila melanogaster reguluje expresi transkripčního faktoru a významného lidského onkogenu c-Myc. Diplomová práce je zaměřena na objasnění vlivu...
|
|
|
Hvězdicovité polymerní nosiče léčiv pro cílenou dopravu a pH-řízené uvolňování léčiva
Bittner, Matyáš ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Liberda, Jiří (oponent)
Tato diplomová práce přináší nové poznatky o designu, syntéze, fyzikálně-chemické charakterizaci a biologické aktivitě nových hvězdicovitých konjugátů založených na HPMA zamýšlených k léčbe pevných nádorů. V současnosti je popsáno mnoho různých vodorozpustných systémů určených k transportu léčiv založených na N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidových (HPMA) kopolymerech. V této práci popisujeme syntézu a fyzikálně-chemickou charakterizaci vysokomolekulárních hvězdicovitých konjugátů založených na HPMA polymerních nosičích s nízkou disperzitou připravených kontrolovaným "roubováním" HPMA kopolymerů na PAMAM dendrimerové jádro. S cílem udržet disperzitu nosiče léčiva pokud možno co nejnižší, bylo pro syntézu nových HPMA kopolymeů použita nová metoda polymerizace: Reversible Addition-Fragmentation Chain transfer (RAFT) polymerisation. Koncové reaktivní skupiny polymerních prekurzorů byly následně použity pro "roubování" na PAMAM jádro pomocí karbodiimidové kondenzace, případně 1,3- cykloadice azidu na trojnou vazbu vedoucí k syntéze hvězdicovitých vysokomolekulárních nosičů léčiv. Popsaný postup syntézy umožňoval přípravu hvězdicovitých konjugátů o Mw mezi 1.105 a 3.105 g/mol a o nízké distribuci Mw. Modelové léčivo doxorubicin (Dox) bylo vázáno kovalentně přes hydrazonovou spojku senzitivní k pH k...
|
|
|
Molekulární mechanismus karcinogenity aristolochové kyseliny
Levová, Kateřina ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent) ; Souček, Pavel (oponent)
Aristolochové kyseliny (AA) jsou karcinogenní a nefrotoxické alkaloidy z rostlin čeledi podražcovitých (Aristolochiaceae). Aristolochová kyselina I (AAI), která je hlavní toxickou komponentou AA, je příčinou nefropatie vyvolané AA (Aristolochic acid nephropathy, AAN) a podílí se také na vývoji balkánské endemické nefropatie (Balkan endemic nephropathy, BEN). Obě choroby se projevují selháním ledvin a tvorbou nádorů v urotheliální tkáni, vznikajících působením karcinogenních AA. Za skutečnost, že tyto choroby nepostihly všechny osoby, které byly vystaveny působení AA, mohou být zodpovědné rozdílné aktivity a koncentrace enzymů metabolisujících AAI. Poznání enzymů metabolisujících AAI a také vliv na jejich exprese a aktivity jsou důležité pro posouzení, zda daní jedinci jsou, a v jaké míře, ohroženi při vystavení tomuto karcinogenu. Aristolochová kyselina I (AAI) může být metabolisována několika typy reakcí. Stejně jako u většiny nitroaromátů, je hlavní aktivační metabolickou cestou AAI redukce nitroskupiny za vzniku cyklického nitréniového iontu, který se může vázat na purinové báze a dochází tak k tvorbě aduktů AAI s DNA. Při detoxikačních reakcích je AAI oxidačně demethylována cytochromy P450 za tvorby 8-hydroxyaristolochové kyseliny Ia (AAIa). V předkládané disertační práci byl sledován...
|
host ::
RSS.