|
|
PRODUCTION OF BETA-GLUCANS AND OTHER POLYSACCHARIDES BY YEAST AND MICROALGAE
Byrtusová, Dana ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Kovalčík, Adriána (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Beta ()–glucans are polysaccharides composed of D-glucose monomers. Nowadays, -glucans are gaining attention due to their attractive immunomodulatory biological activities, which can be utilized in pharmaceutical or food supplementation industries. Nowadays, the only biotechnological yeast source is Saccharomyces cerevisiae. However, some carotenogenic Basidiomycetes yeasts, previously explored for lipid and carotenoids co-production, could potentially co-produce a significant amount of –glucan. In the present Doctoral Thesis, the culture conditions were optimized for the production of -glucans and other microbial polysaccharides at carotenogenic yeast and microalgae. The genera of Rhodotorula, Sporobolomyces, Cystofilobasidium, and Dioshegia were tested. From non-carotenogenic yeast, the Metschnikowia genera and some ascomycetes yeast were selected together with some green and red algal strains. The experimental part is focused also on the possibility of co-production of other metabolites, like lipids, pigments, and extracellular polymers. In the first part of the experiment, the effect of four C/N ratios (10:1, 40:1, 70:1 and 100:1) on the production of biomass, -glucans, carotenoids, and lipids was evaluated et yeast strains. From all strains, the S. cerevisiae CCY 21-4-102, C. infirmominiatum CCY 17-18-4, P. rhodozyma CCY 77-1-1 and R. kratochvilovae CCY 20-2-26 exhibited the highest -glucans production and were chosen for next analysis, mainly salt stress, temperature, and nitrogen sources in the culture medium. Additionally, R. kratochvilovae CCY 20-2-26 produces extracellular glycolipids and S. pararoseus CCY 19-9-6 extracellular polysaccharides. Next, the diversity of -glucan content among the other twelve Saccharomyces strains and polysaccharides production at microalgae was assessed.
|
|
|
Komplexní analýza léčivých rostlin a jejich potenciál při využití v potravinářském průmyslu
Burdějová, Lenka ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Šilhár, Stanislav (oponent) ; Polovka, Martin (vedoucí práce)
Předložená dizertační práce se zabývá komplexní charakterizací extraktů z léčivých rostlin pomocí spektroskopických a chromatografických technik s důrazem na vliv rozpouštědla, posklizňové úpravy vzorku, lokality a roku produkce na vybrané parametry. Část práce je věnována aplikaci vybraných extraktů z léčivých rostlin ve vhodné formě do nápojů. Tematicky je práce rozdělena do dvou částí. V první části práce byly pomocí kombinace metod elektronové paramagnetické rezonance, ultrafialové viditelné spektroskopie, kapalinové chromatografie a optické emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem charakterizovány vodné, ethanolové a dimethylsulfoxidové extrakty z 10 vybraných druhů léčivých rostlin, které byly sbírány ve dvou různých lokalitách v průběhu dvou let (2015, 2016) a posklizňově upravovány dvěma způsoby (zmražení, sušení). Celkově bylo sledováno ve všech extraktech 39 parametrů: konkrétně obsah celkových fenolických látek, flavonoidů, 14 konkrétních fenolických sloučenin, barevné charakteristiky v systému CIE L*a*b* (L*, a*, b*, C*, h°, BI), radikál-zhášecí aktivita s využitím kation radikálu 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonové kyseliny), antioxidační/prooxidační aktivita technikou spinových lapačů v systému 5,5-dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid (DMPO)/peroxodisíran draselný a obsah 15 minerálních látek (Al, As, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, Pb, Zn). Výsledky prokázaly, že sledované parametry léčivých rostlin jsou různou mírou ovlivňovány použitým extrakčním systémem, posklizňovou úpravou vzorků, rokem produkce, původem vzorků (lokalitou) i druhovou skladbou. Bylo prokázáno, že druh extrakčního činidla výrazně ovlivňuje složení extraktů. Na základě analýz byl jako nejvhodnější systém pro potravinářskou aplikaci – izolaci hlavních funkčních složek (fenolických látek, flavonoidů) vybrán 50% ethanol, úprava rostlin sušením a z jednotlivých druhů máta peprná, meduňka lékařská, třezalka tečkovaná a šalvěj lékařská. Druhou částí práce byla aplikace extraktů vybraných léčivých rostlin do nápojů. Pro aplikaci byly vybrány výše zmíněné rostliny, 25% ethanol místo 50% ethanolu (vzhledem k limitaci obsahu ethanolu v konečné surovině). V první fázi byla optimalizována extrakce léčivých rostlin. Byl vybrán vhodný poměr materiálu a rozpouštědla (1:10), doba extrakce (8 h) a zjištěna nasákavost bylin (50–62 %). Vyrobený extrakt byl po filtraci aplikován k sirupovému základu ve vybraných poměrech pro výrobu jednodruhových sirupů a senzoricky testován za účelem výběru vhodné receptury, příchutě a základu pro výrobu dvoudruhových sirupů. Nejchutnějším a celkově nejpřijatelnějším z hlediska flavouru byl vyhodnocen mátový sirup a jako základ pro dvoudruhové sirupy byl vybrán šalvějový sirup. V rámci dalšího testování byla vybírána nejvhodnější receptura dvoudruhového sirupu, senzoricky nejvhodnější příchuť a testováno, zda by bylo vhodné vybrané dvoudruhové sirupy dobarvovat. Preferenčně bylo zjištěno, že dvoudruhové sirupy není nutno dobarvovat. Na základě senzorické analýzy bylo prokázáno, že z jednodruhových sirupů byl nejlépe hodnocen mátový sirup, z dvoudruhových sirupů šalvějovo-mátový, tyto sirupy by po dalším testování bylo možné uvést do výroby a obohatit tak trh s potravinami.
|
|
|
Využití separačních metod pro studium vybraných léčiv a pesticidů ve vodách
Burešová, Jitka ; Hajšlová, Jana (oponent) ; Chýlková, Jaromíra (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Vávrová, Milada (vedoucí práce)
Dizertační práce je zaměřena na získání poznatků o průniku pesticidů a léčiv do vodního prostředí. Cílem bylo vyvynutí a ověření optimální metody vhodné pro dlouhodobé sledování výskytu vybraných pesticidů a léčiv v povrchových vodách. Z léčiv byla pro sledování vybrána velmi často užívaná analgetika ibuprofen a diklofenak a antiepileptikum karbamazepin. Dále bylo pro sledování vybráno celkem 41 pesticidů, pozornost byla zaměřena na skupinu močovinových pesticidů a skupinu fenoxykarboxylových kyselin, dále na vybrané pesticidy patřící do skupiny prioritních látek, na vybrané pesticidy určené jako normy environmentální kvality a vybrané pesticidy, jejichž roční spotřeba v České republice převyšuje 30 tun. Pro stanovení byla vybrána metoda kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS). Vybrané analyty byly stanovovány ve dvou skupinách, 10 analytů při negativní ionizaci a 34 analytů při pozitivní ionizaci. Pro přečištění a zakoncentrování vzorků byla používána exprakce pevnou fází (SPE). Vypracovaná metodika byla ověřena validací a použita pro sledování výskytu vybraných látek ve vzorcích povrchových vod z oblasti povodí řeky Moravy. Vzorky byly odebírány jedenkrát měšíčně po dobu dvou let na řekách Moravě a Svratce. Po dobu jednoho roku byl sledován tok řeky Blaty a potoka Nivničky. Jednorázově byl také prozkoumán tok řeky Litavy, ze které byly odebrany v jeden den čtyři vzorky tak aby pokryly celý její tok. Výběr menších toků pro sledování proběhl na základě pravděpodobnosti výskytu pesticidů, vzhledem k jejich průtoku hojně zemědělsky obdělávanými oblastmi. Léčiva ibuprofen a diklofenak byla detekována ve všech odebraných vzorcích, karbamazepin v převážné většině. Mezi nejčastěji se vyskytující pesticidy patřily bentazon, diuron, isoproturon, karbendazim, MCPA, MCPP, propikonazol, tebukonazol a 2,4-D.
|
|
|
Faktory ovlivňující senzorickou jakost analogů tavených sýrů
Sůkalová, Kateřina ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Diviš, Pavel (oponent) ; Buňka,, František (vedoucí práce)
Předložená dizertační práce se zabývá sledováním senzorické kvality tavených sýrových analogů, se zaměřením především na chutnost (flavour) a s ní související obsah těkavých (aromaticky aktivních) látek. Modelové vzorky analogů byly vyrobeny standardním postupem pro výrobu tavených sýrů na Univerzitě Tomáše Bati ve Zlíně. Experimentální část byla rozdělena do dvou experimentů, které se lišily složením modelových vzorků analogů. V prvním experimentu byl tradiční tuk (máslo) zcela nahrazen vybranými rostlinnými tuky (palmový, kokosový, směsný), ve druhém experimentu byla nahrazena pouze část (1 % hm. - vyjádřeno na celkovou hmotu vzorku) másla rostlinnými oleji (meruňkový, lněný, rybízový, hroznový). Pro stanovení těkavých látek byla použita mikroextrakce tuhou fází ve spojení s plynovou chromatografií s plameno-ionizační detekcí. Pro hodnocení senzorické kvality vzorků, se zaměřením především na flavour, byly použity metody vycházející z platných mezinárodních norem, konkrétně hodnocení pomocí stupnic (ČSN ISO 4121), profilový test (ČSN EN ISO 13299) a pořadová zkouška (ČSN ISO 8587). Podstatou práce bylo posouzení vlivu přídavku různých rostlinných tuků/olejů na uvedené parametry, zároveň byly sledovány jejich změny v průběhu 6 měsíčního skladování (při 6 °C). Výsledky prokázaly, že použitý rostlinný olej ovlivňuje jak senzorickou kvalitu, tak i obsah a složení těkavých látek vyrobených analogů. Výrazné rozdíly mezi vzorky byly především v chuti, vůni a celkové přijatelnosti. Zhoršující se celkovou přijatelnost vzorků lze v experimentu I vyjádřit pořadím: výrobek s máslem kokosovým palmovým směsným tukem; v případě experimentu II: výrobek s máslem meruňkovým = lněným = hroznovým rybízovým olejem. Jako nevhodné se pro výrobu analogů ukázaly být směsný tuk, rybízový a hroznový olej, naopak nejlépe byly hodnoceny analog s kokosovým tukem a meruňkovým olejem. Na základě výsledků senzorické analýzy bylo prokázáno, že vzorky si udrží dobrou senzorickou kvalitu min. po dobu 3 měsíců při dodržení nízké skladovací teploty ( 6 °C). Analog s kokosovým tukem, jehož chuť, vůně a přijatelnost byly hodnoceny jako velmi dobré, a s meruňkovým olejem, jehož chuť, vůně a přijatelnost byly hodnoceny dokonce jako výborné, by mohly obohatit nabídku potravin na trhu.
|
|
|
Zavedení kontaktních testů ekotoxicity pro hodnocení terrestrických ekosystémů
Modlitbová, Pavlína ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Beklová, Miroslava (oponent) ; Demnerová, Kateřina (oponent) ; Vávrová, Milada (vedoucí práce)
Tématem předložené dizertační práce bylo provedení testů toxicity s využitím testovacího organismu ze zástupců suchozemských stejnonožců Porcellio scaber. Tento testovací organismus byl zvolen jako nejvhodnější pro posouzení toxicity vybraných anorganických sloučenin kontaminujících terestrický ekosystém. Jeho výběr byl proveden na základě důkladně zpracované metodiky tohoto testu, dále známých biologických a biochemických vlastností výše specifikovaného živého organismu, případně na jeho ekologické relevantnosti. Kromě klasických endpointů, jakými jsou mortalita, změna hmotnosti testovacích jedinců a také vliv přítomnosti a koncentrace kontaminantů na konzumaci stravy, byly rovněž sledovány změny v morfometrické charakteristice, a to na úrovni tkání a buněk, cytotoxicita a rovněž byla posuzována možná bioakumulace v různých částech těla tohoto organismu. Vybrané testované látky lze zařadit do oblasti nanočástic a anorganických solí. U vybraných nanočástic zlata byla provedena kompletní ekotoxikologická studie na několika úrovních organizace živé hmoty (organismus, tkáň, buňka). Pro vybrané soli byla provedena studie, která byla zaměřená především na chování organismů a klasické endpointy.
|
|
|
Mykotoxiny v pivovarských surovinách a v pivu
Běláková, Sylvie ; Vávrová, Milada (oponent) ; Márová, Ivana (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Čáslavský, Josef (vedoucí práce)
Vypracovaná disertační práce se zabývá problematikou mykotoxinů v pivovarských surovinách a pivu. Pozornost byla věnována především vybraným fusariovým mykotoxinům (deoxynivalenol, zearalenol, T-2 toxin a HT-2 toxin), ochratoxinu A a aflatoxinům B1, B2, G1 a G2. Náplní disertační práce bylo optimalizovat a validovat analytické metody pro stanovení výše uvedených mykotoxinů v pivovarských surovinách a v pivu. Pro separaci analytů byla použita metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostně – spektrometrickou detekcí (HPLC-MS/MS) a metoda ultravysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí (UPLC/FLR). Tyto analytické metody byly následně aplikovány při zmapování výskytu fusariových mykotoxinů ve sklizních sladovnického ječmene v České republice a v sladařském a pivovarském průmyslu při sledování úrovně kontaminace mykotoxiny. Dále byly realizovány experimenty týkající se přepěňování piva, neboť primární gushing – přepěňování piva – souvisí stejně jako mykotoxiny s přítomností mikroskopických vláknitých hub v surovinách pro výrobu piva. Práce, ve kterých jsou tyto metody podrobně uvedeny, jsou součástí disertace (Příloha I – V). Ze všech publikovaných výsledků je zřejmé, že výskyt mykotoxinů v obilovinách včetně ječmene je přirozený a nelze mu zcela zabránit ani při dodržení podmínek správné zemědělské praxe. Je známo, že určitý podíl mykotoxinů přítomných v kontaminovaném sladovnickém ječmeni může přejít díky svým chemickým a fyzikálním vlastnostem do finálního produktu – piva. Nalezené koncentrace mykotoxinů však nepředstavují významné zdravotní ohrožení spotřebitelů.
|
|
|
Use of some molecular techniques to metabolic characterization of industrially significant yeasts
Kostovová, Iveta ; Brázda, Václav (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Carotenoids, ergosterol and fatty acids are valuable compounds used in food, feed and cosmetic industries. Since their conventional sources depend on weather conditions, season, geographical location, and availability of agricultural land, it is necessary to increase its availability for constantly increasing demand. Microbial production of aforementioned compounds exploiting carotenogenic yeast is promising due to their extraordinary capability to simultaneously produce carotenoids, ergosterol and fatty acids. Hereby Doctoral Thesis was aimed to provide the molecular and metabolic characterisation of various carotenogenic yeasts and their potential for industrial applications. For this purpose, the first experimental parts are focused in great detail on yeast species R. mucilaginosa and R. toruloides, their production properties and the influence of nutritional stress and different carbon sources, such as xylose and glycerol. Besides the detailed characterization of their production properties, were these strains also characterized by molecular methods, including sequence analysis of ITS1, ITS2 and D1/2 of the ribosomal operon and analysis of mini and microsatellite sequences M13 and GTG5. R. toruloides is known as an excellent producer of fatty acids and because of it, it recently became a target carotenogenic yeast for the development of tools for its genetic manipulation. In this work were successfully prepared genetically modified clones of R.toruloides bearing over-expressed genes for DGA1 (diacylglycerol acyltransferase) and GPD1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase). Their production of fatty acids was not higher in comparison to the original strain. Therefore, the next part was focused on the preparation of overproducing mutant strains prepared by random mutagenesis. The combination of nitrogen limitation and the carotenoid production inhibitor diphenylamine led to the successful selection of carotenoid overproducing robust mutant strains with resistance to diphenylamine. The last part of the thesis deals with the production properties of lesser known carotenogenic yeast species among order Sporidiobolales and Cystofilobasidales in comparison to relatively well studied carotenogeic yeast species represented by R. toruloides and P. rhodozyma. The best fatty acid-producing strains were S. metaroseus CCY19-6-20 and C. macerans CCY 10-01-02. Moreover, the best carotenoid producer, R.mucilaginosa CCY 19-04-06, naturally produced lycopene in amounts representing more than 80 % of total carotenoids.
|
|
|
PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF NATURAL EXTRACTS WITH ANTIMICROBIAL EFFECT
Vysoká, Marie ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Worldwide consumption of antibiotics has increased drastically in the past few decades. The application of antibiotics has led to the production of antibiotic resistance genes (ARGs) which represent a growing and serious human health threat worldwide. The use of natural or alternative medicines increased markedly over the last few years. Therefore, much attention is paid to natural products, which could be used as effective drugs to treat human diseases, with high efficiency against pathogens and negligible side effects. Yeast biomass that contains valuable fatty acids, carbohydrates, nucleic acids, vitamins, and minerals was tested in the potential combination with plant extracts as a food supplement. This doctoral thesis is focused on impact assessment of selected plant extracts such as acai, clove, turmeric, ginger, ginseng and oregano and their antimicrobial activity, antioxidant activity, cytotoxicity and important nutritional benefits. Subsequently, the biological effects of yeast biomass of the strains Metschnikowia pulcherrima CCY 029-002-145, Cystofilobasidium infirmominiatum CCY 17-18-4, Phaffia rhodozyma CCY 77-1, Rhodotorula kratochvilovae CCY 20-2-26 were tested. These yeasts were chosen especially for the high content of active substances in the produced biomass. In conclusion, the potential synergistic effect of plant extracts in combination with yeast biomass to increase the overall antimicrobial effect, antioxidant activity and effect on the growth of Caco-2, B16F1 and HaCaT cell lines was assessed. Considering the results achieved, it is appropriate to include immortalized yeast biomass in combination with natural extracts in food supplements in an appropriate form, as it is clear that there is some direct relationship between cell viability and apoptosis. All microbial extracts showed some positive results for the apoptosis of cancer cell lines and at the same time no cytotoxic effects on non-cancer cell lines at identical concentrations.
|
|
|
Utilisation of fluorescence techniques for analysis of industrially relevant microorganisms
Müllerová, Lucie ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Krčma, František (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Single-cell analysis techniques are very important when studying relevant biotechnological microorganisms. In biotechnological processes, the optimum is to have fast, efficient and real-time analyses that can be done with minimal preparations. Therefore, we looked at autofluorescence as a possible and natural marker when employing fluorescence microscopy and flow cytometry. First, it has been established, based on the emission spectra, that the green autofluorescence of the bacteria used – Cupriavidus necator H16 and its non polyhydroxyalkanoates (PHA) producing mutant Cupriavidus necator PHB-4, is caused predominantly by flavins. The maxima of emission spectra were 510 – 550 nm for FAD, FMN and riboflavin whose spectra could not be distinguished, and 515 nm for both strains of Cupriavidus necator. Two maxima of excitation spectra of the bacteria were found – one in the range 360 – 370 nm and another around 440 nm, and so a new protocol for fluorescence microscopy has been established - the laser used was 467 nm and the emission filter chosen for the detection was 520/35 nm. Flavins and their autofluorescence can also be used in combination with other fluorophores when the need for multi-parametrical analyses arises, but it’s highly recommended the other dyes emit other than green fluorescence in the band of 500 – 550 nm or/and have an average fluorescence lifetime other than 3.2 – 3.7 and 4.2 - 4.9 ns. These values stayed constant even when the cells were exposed to various cultivation and even stress conditions. That makes them a very stable marker compared to the dynamic marker of fluorescence intensity that changes immediately after a change in the environment. A new staining protocol for C. necator using PHA-specific hydrophobic probe BODIPY 493/503 was optimised. The optimal staining concentration of the lipophilic dye BODIPY 493/503 was determined to be 2.5 µg ml-1 and it can be used in combination with propidium iodide. The BODIPY 493/503 staining protocol has been used when analysing the morphology of the PHA-synthesising bacteria Halomonas halophila. Further, to study the UV-protective properties of PHA in Cupriavidus necator, another staining essay has been optimised. It has been established that the ROS sensitive dye CM-H2DCFDA gives better performance than its non-methylated form. Also, the UV-protective characteristics of the PHA-synthesising strain Cupriavidus necator H16 were confirmed when compared to its non-PHA synthesising strain C. necator PHB-4.
|
|
|
Využití hlemýžďovitých v testech ekotoxicity
Fojt, Pavel ; Komendová, Renata (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Zlámalová Gargošová, Helena (vedoucí práce)
Tématem této dizertační práce jsou možnosti využití hlemýžďovitých v testech ekotoxicity. Konkrétně využití kosmopolitního terestrického plže druhu Helix aspersa aspersa (syn. Cantareus aspersus nebo Cornu aspersum). Životní cyklus těchto plžů probíhá ve velmi těsném kontaktu s půdním ekosystémem. Zde se také zúčastňuje některých velmi důležitých procesů, jako je především dekompozice odumřelé organické hmoty. Práce bude soustředěna na vyžití těchto plžů při hodnocení ekotoxicity vybraných elementů, které mohou v různé míře vstupovat do půdního prostředí. Především se bude jednat o hodnocení vlivu těžkých kovů. Dalším aspektem bude také rozdělení ekotoxikologických testů do různých kategorií v závislosti na životním stádiu tohoto organismu a následně srovnání citlivosti daných stádií ke konkrétní úrovni kontaminace určitými polutanty.
|
host ::
RSS.