|
|
Proteomic approach for the study of cancer cell line profiles.
Predná, Nikola ; Langová, Denisa (oponent) ; Strouhalová,, Dana (vedoucí práce)
Triple-negative breast cancer (TNBC), known to be an aggressive subtype of breast cancer, has a dismal prognosis and limited treatment options. As of now, chemotherapy is considered the main treatment option. In order for new effective drugs to be developed, it is crucial to understand the molecular basis of triple-negative breast cancer. As a result, a lot of research on potentially active agents for this particular type of breast cancer have been conducted. Recently, many studies on the matter are carried out using proteomics; a means of studying the proteomes of cancer cells. Cancer cells contain key differences in proteins that regulate the mechanisms of the cell. Eventually, mapping these mechanisms can allow to define the state of an organism. This thesis focuses on the proteomic study of TNBC cells and compares untreated cells with cells that have underwent retinoid therapy. Protein and peptide separation was successfully performed using 1D and 2D gel electrophoresis. In addition, the samples were subjected to enzymatic cleavage of selected proteins which were then identified using MALDI-TOF Mass Spectrometry (MS). Proteins playing a role in the process of epithelial–mesenchymal transition (EMT) were then quantified and compared between the samples.
|
|
|
Proteomic architecture of sperm-egg interactions
Otčenášková, Tereza ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Nedávné pokroky v proteomických metodách poskytují nové poznatky pro biologický výzkum a to včetně oblasti reprodukční biologie. Stanovení proteomického základu spermií je klíčové pro pochopení komplexního procesu interakcí gamet během oplození zahrnující akrozomální reakci. Napříč živočišnými taxony lze pozorovat značné rozdíly ve velikosti, tvaru a molekulárním složení spermií způsobené postkopulačním pohlavním výběrem a fylogenezí. První cílem této disertační práce je characterizovat proteinové složení akrozomu a zjistit tak jeho další funkční význam v interakci spermie a vajíčka. Dále se zaměřujeme na možné souvislosti mezi proteinovým složením spermií a morfologickou diverzifikací spermií, mírou výskytu kompetice spermií a fylogenetickou příbuzností zkoumaných druhů. Pro analýzy byli použiti samci odchycení v přírodě z přirozených populací druhů Mus musculus musculus, Apodemus flavicollis, Microtus arvalis (řád Hlodavci), Acrocephalus palustris, Chloris chloris, Phylloscopus collybita, Cinclus cinclus, Hirundo rustica a Taeniopygia guttata chovaní v zajetí (řád Pěvci). Jako hlavní metodologický přístup byla v celé práci použita nano kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Naše data ukazují, že biologické role akrozomu hlodavců nespočívají pouze v usnadňování...
|
|
|
Intermediate filament proteins of Preaxostyla flagellates
Švagr, Ezra ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Varga, Vladimír (oponent)
6 Abstrakt Monocercomonoides exilis a Paratrimastix pyriformis jsou protista ze skupiny Preaxostyla (Excavata), mají exkavátní morfologii, která se považuje za ancestrální formu cytoskeletální organizace eukaryotických buněk. Podstatnou částí této morfologie jsou vlákna složená z dosud neidentifikovaných proteinů. Tato práce staví na teorii, že tyto vlákna jsou složena z proteinů Intermediárních filament (IF proteinů). IF proteiny jsou polyfyletická skupina proteinů, která se podílí na tvorbě mechano-elasticky významných vláken v eukaryotických buňkách. Nejvíce rozšířenou skupinou těchto proteinů jsou SF-assembliny, homology těchto proteinů byly poprvé popsány u druhu Chlamydomonas reinhardii, giardiny, proteinová rodina poprvé popsaná u Giardia intestinalis, jsou také příbuzné s těmito proteiny. Identifikace SF-assemblinů e u M. exilis a P. pyriformis by dále upevnila pozici SF-assemblinů jako obecně přítomného proteinu v eukaryotickém cytoskeletu. Cílem této práce bylo studovat proteiny přítomné v cytoskeletu exkavát dvěma způsoby. Zaprvé identifikovat proteiny v obohacené cytoskeletální frakci získané z kultur M. exilis a P. pyriformis. Zadruhé, lokalizovat SF-assembliny v obou protistech pomocí protilátek a expanzní mikroskopie. Protokol pro expanzní mikroskopii byl optimalizován pro oba organismy. V...
|
|
|
Proteom rostlin v reakci na abiotický stres
Čotková, Veronika
Rostliny si se svým přisedlým způsobem života vyvinuly komplexní mechanismy jak se vyrovnat s nepříznivými podmínkami prostředí. Tato diplomová práce shrnuje současné znalosti na toto téma a zaměřuje se na světlo, teplotu a fytohormony v odpovědích rostlin na abiotický stres. Praktická část se věnuje proteomice a dokončuje a navazuje na projekt zahájený během mé bakalářské práce. Transgenní klíční rostliny Arabidopsis nesoucí inducibilní cytokinin oxidázu/dehydrogenázu z ječmene (CaMV35S>GR>HvCKX2) byly profilovány pro objasnění odpovědí na úrovni proteomu na snížené hladiny cytokininů pod teplotním stresem za standardní (80 umol.m-2.s-1) a nízké intenzity světla (20 umol.m-2.s-1). Pomocí 2-DE analýzy a analýzy pomocí hmotnostní spektrometrie se podařilo celkem objevit 63 rozdílně abundantních proteinů zahrnutých v různých metabolických procesech. Tato data poskytují důkaz o spojení mezi teplotní, světelnou a cytokininovou signalizací v Arabidopsis a budou použita při modelování interakcí cytokininy - světlo - teplota.
|
|
|
Isolation and characterisation of extracellular vesicles of parasitic helminths
MAZANEC, Hynek
Exkrečně sekreční produkty (ESP) slouží jako důležití mediátoři mezibuněčných a mezidruhových komunikací. Původně se předpokládalo, že jsou vylučovány hlavně v rozpustné formě, ale nedávné objevy naznačují i jejich vylučování za pomoci extracelulárních vezikul (EV). Tyto membránové částice poskytují svému obsahu ochranu před degradací a zároveň i cílený transport skrz specifických receptorů na svém povrchu. Díky tomu jsou studovány jako silné imunomodulátory vztahů mezi hostitelem a patogenem. S ohledem na parazitické helminty, EV jsou studovány jako prostředky pro diagnostiku, vakcinaci či terapii. Nicméně jejich obecná biologie, zejména pak jejich biogeneze, je stále špatně prostudována v porovnání s jejich potenciální funkců. Cílem této práce je tedy podrobněji prozkoumat sekreční aktivitu EV u různých zástupců tasemnic a jejich životních stádií. Životní cyklus tasemnice Schistocephalus solidus byl založen v laboratorních podmínkách za účelem studia sekrece EV napříč jednotlivými stádii. Zároveň jsme prozkoumali hlavní cesty biogeneze EV u tasemnice Hymenolepis diminuta za pomoci ultrastrukturních a proteomických analýz. Oba směry zároveň umožnily porovnání tvorby EV u tasemnic s různými typy hostitelů.
|
|
|
Integrated multi-omics analysis of chemical signaling in wild rodents
Matějková, Tereza ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Macholán, Miloš (oponent) ; Bryja, Josef (oponent)
Bakterie žijící v symbióze se svým hostitelem v takzvaných mikrobiomech jsou jedním z hlavních pilířů evoluce živočichů, včetně evoluce jejich chemické komunikace. Fenotyp, genotyp a mikrobiom laboratorních živočichů chovaných po generace ve sterilních podmínkách se však od jejich divokých předků změnil, což vede k výrazným rozdílům mezi výsledky získanými z laboratorních organismů a z jejich divokých protějšků. Tato práce se zaměřuje na chemickou komunikaci u volně žijících hlodavců. Konkrétně zkoumá části těla, které se přímo podílí na chemické komunikaci (tj. ústa, pochva a střeva) a které jsou zároveň obývány mikrobiomy produkující chemické signály. Změny mikrobiomu, proteomu a metabolomu divokých myší jsou v této práci studovány pomocí sekvenování nové generace a nejmodernější proteomové a metabolomové chromatografie - hmotnostní spektrometrie. Práce analyzuje změny mikrobiomu v rámci přesunu divokých jedinců do zajetí, společného soužití divokých a laboratorních zvířat a také v kontextu hormonálních změn během estrálních cyklů. Dále tato práce diskutuje rozdíly a podobnosti v mikrobiomu, proteomu a metabolomu na úrovni různých druhů (Apodemus sp.), poddruhů (Mus musculus domesticus vs. musculus) a prostředí (přirozený vs. laboratorní původu). Výsledky ukazují, že mikrobiom zůstává během...
|
|
|
Metodika pro identifikaci cizích amyláz v medu
Erban, Tomáš ; Shcherbachenko, Elena ; Talacko, Pavel ; Harant, Karel
Včelí med je unikátní přírodní produkt. Med je odedávna využíván jako lahodná sladká potravina. Je však ceněn také pro mnohostranné léčivé účinky. Med bohužel patří mezi nejfalšovanější potraviny. Do medu nesmí být nic přidáváno a nesmí být upravován. S medem je také potřeba zacházet opatrně, protože jeho kvalitu může negativně ovlivnit způsob zpracování. Med může výrazně ovlivnit nešetrné rozehřívání. I přes velký pokrok v analytických metodách se nedaří prokázat všechny falšované medy. Některé způsoby falšování jsou totiž dosti sofistikované. Proto je potřeba hledat nové přístupy a metody pro odhalování falšování medu. Aby mohl být med prodáván, musí splňovat mezinárodně platné normy, které platí také na národních úrovních s případnými modifikacemi. Jedním z důležitých parametrů pro med je míra diastázové neboli amylázové enzymové aktivity, která je uznávaným indikátorem čerstvosti a kvality medu. Snížená diastázová aktivita pod stanovenou normu může indikovat starý med, ale může být také důsledkem nešetrného zacházení s medem. V neposlední řadě může být diastázová aktivita snížena v důsledku falšování medu, jako je jeho ředění cukernými náhražkami. Někdy může být amylázová aktivita uměle nastavena přidáním enzymů. Takto falšovaný med sice splní stanovené legislativní požadavky pro uvedení na trh, ale nastavením amylázové aktivity je porušen zákaz o přidávání látek do medu. Dosud používané metody neumožňovaly odhalení takovéhoto způsobu falšování. Proto se tato metodika zaměřuje právě na specifickou identifikaci cizích amyláz, které se mohou v medu vyskytovat. Metodika umožňuje identifikovat bottom-up shotgun proteomickým přístupem prakticky jakoukoliv cizí amylázu v medu. Identifikované specifické peptidy získané na základě tohoto metodického postupu mohou být později využity pro vývoj cílené metody pro identifikaci cizích amyláz.
Plný text:  PDF
|
|
|
Příprava a využití proteas vhodných ke studiu struktury proteinů.
Jirečková, Barbora ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vaňková, Pavla (oponent)
Vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) je metoda, která umožňuje studium struktury a dynamiky proteinů. Pro lokalizaci této výměny je do HDX-MS zařazena proteolýza analyzovaného proteinu, která určuje prostorové rozlišení. Standardně se používá pepsin, který má ale své limitace, a také štěpení pouze jednou proteasou často neposkytuje optimální prostorové rozlišení. V několika publikacích byl akcentován význam alternativních proteas nepenthesinu-2 (Nep-2) a aspergillopepsinu (XIII), které oproti pepsinu štěpí za bazickými aminokyselinami. Při studiu na prolin bohatých proteinů získává význam prolyl endoproteasa z Aspergillus niger (AnPEP). Tato práce se zabývá charakterizací imobilizovaného AnPEPu v kombinaci s proteasami pepsinem, aspergillopepsinem nebo Nep-2 za účelem jejich aplikace v HDX-MS. Nejprve byly na sadě modelových proteinů otestovány kolony s pouze jednou proteasou. Bylo zjištěno, že imobilizovaný AnPEP oproti ostatním proteasám nemá optimální štěpné charakteristiky. Za účelem spojení výhod výše uvedených proteas byly modelové proteiny štěpeny pomocí kolon s AnPEP koimobilizovaným s pepsinem, Nep-2 nebo XIII a také pomocí dvou proteasových kolon v sériovém zapojení (vždy AnPEP kolona s pepsinovou, Nep-2 nebo XIII kolonou v obou směrech). V rámci štěpení...
|
|
|
Výzkum epigenetických aspektů kmenových buněk krvetvorby a spermatogeneze.
Hybešová, Michaela ; Pimková, Kristýna (vedoucí práce) ; Děd, Lukáš (oponent)
Diferenciace kmenových buněk je řízená koordinovanou regulací genové transkripce. Jedním z regulačních faktorů je rozvolnění chromatinu a zpřístupnění DNA k transkripčním faktorům. Remodelace chromatinu je zajišťována remodelačními komplexy. ISWI chromatin remodelující ATPáza Smarca5 (S5) je významným faktorem remodelačních komplexů. Jedná se o vysoce konzervovaný chromatin-remodelační faktor, který se nachází v několika komplexech oligopodjednotek a tvoří zde katalytickou podjednotku. V těchto komplexech aktivně reguluje strukturu a přestavbu nukleozomu během replikace, oprav a transkripce DNA. Bylo zjištěno, že S5 je klíčový protein pro embryonální vývoj. Jeho nedostatek vede k poruchám krvetvorby a vývoji samčích pohlavních orgánů. V této práci jsme se zaměřili na roli S5 v hematopoéze a spermatogenezi. Pomocí myšího modelu s transgenní expresí S5, ko-imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie jsme identifikovali komplexy, v nichž se S5 nachází v hematopoetických orgánech a v buňkách v testes. Studovali jsme také fenotypové následky deficitu S5 v myších testes a zjistili, že vede k poruše vývoje spermií a samčí sterilitě. Pomocí transkriptomické a proteomické analýzy jsme identifikovali, některé molekulární programy, které by mohly k poruchám reprodukce vést. Naše práce naznačuje, že S5 je...
|
|
|
Identification and characterization of ciliary tip proteins
Gorilák, Peter ; Varga, Vladimír (vedoucí práce) ; Lánský, Zdeněk (oponent) ; Dean, Samuel (oponent)
Distální konec řasinky/bičíku, také známý jako doména ciliární špičky (CTD), je nepostradatelná pro strukturu a funkci eukaryotických řasinek. Lepšímu porozumění této domény brání nedostatečné znalosti jejích proteinových komponentů. Cílem dizertační práce bylo ověřit lokalizaci vybraných známých proteinů CTD savčích řasinek, a testovat lokalizaci kandidátních CTD proteinů, jejichž ortology se nacházejí na špičce bičíku evolučne vzdáleného prvoka Trypanosoma brucei. Pomocí našeho lokalizačního postupu jsme identifikovali dva proteiny, které výrazně lokalizují do CTD primární řasinky. Jeden z těchto proteinů, ZC2HC1C, navíc také lokalizuje do stacionárních bodů podél axonemy, jejichž pozice se shodují s místy zastavení a otáčení intraflagelárních vlaků. Předpokládáme, že se může jednat o konce sub-distálně končících axonemalních mikrotubulů. Dále prokazujeme, že protein ULK4 lokalizuje do CTD pohyblivých ependymálních řasinek, ale ne do CTD primárnich řasinek, což je v souladu s dříve publikovanými fenotypy u ULK4 knock- outových myší a dokládá rozdíly ve složení CTD těchto dvou typů řasinek. Nakonec jsme ukázali, že Expanzní mikroskopie je rychlá a robustní super-rezoluční metoda, vhodná pro ultrastrukturální a lokalizační studie CTD savčích řasinek a bičíků T. brucei.
|
host ::
RSS.