|
|
Příprava a využití proteas vhodných ke studiu struktury proteinů.
Jirečková, Barbora ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vaňková, Pavla (oponent)
Vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) je metoda, která umožňuje studium struktury a dynamiky proteinů. Pro lokalizaci této výměny je do HDX-MS zařazena proteolýza analyzovaného proteinu, která určuje prostorové rozlišení. Standardně se používá pepsin, který má ale své limitace, a také štěpení pouze jednou proteasou často neposkytuje optimální prostorové rozlišení. V několika publikacích byl akcentován význam alternativních proteas nepenthesinu-2 (Nep-2) a aspergillopepsinu (XIII), které oproti pepsinu štěpí za bazickými aminokyselinami. Při studiu na prolin bohatých proteinů získává význam prolyl endoproteasa z Aspergillus niger (AnPEP). Tato práce se zabývá charakterizací imobilizovaného AnPEPu v kombinaci s proteasami pepsinem, aspergillopepsinem nebo Nep-2 za účelem jejich aplikace v HDX-MS. Nejprve byly na sadě modelových proteinů otestovány kolony s pouze jednou proteasou. Bylo zjištěno, že imobilizovaný AnPEP oproti ostatním proteasám nemá optimální štěpné charakteristiky. Za účelem spojení výhod výše uvedených proteas byly modelové proteiny štěpeny pomocí kolon s AnPEP koimobilizovaným s pepsinem, Nep-2 nebo XIII a také pomocí dvou proteasových kolon v sériovém zapojení (vždy AnPEP kolona s pepsinovou, Nep-2 nebo XIII kolonou v obou směrech). V rámci štěpení...
|
|
|
Vývoj alternativních proteolytických postupů pro identifikaci proteinu
Jirečková, Barbora ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Hnízda, Aleš (oponent)
4 Abstrakt Metody výzkumu proteinů založené na hmotnostní spektrometrii přibývají v posledních letech na svém významu. Pro takzvaný bottom-up přístup je zásadní proteolytický krok, který určuje úspěšnost a relevanci identifikace a charakterizace proteinu, sekvenční pokrytí a ve vodík/deuteriové výměně spojené s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) prostorové rozlišení. Běžně používané proteázy mají ale své limitace. Z tohoto důvodu je snahou najít alternativy, které mají především jiné štěpné preference a aktivitní profil. AnPEP proteáza (prolyl endoproteáza z Aspergillus niger) je výhodná v tom, že je možné ji získat komerčně ve velkém množství a vyznačuje se štěpením za prolinem, v blízkosti kterého mnohé proteázy neštěpí. Tato práce se zabývá optimalizací štěpení AnPEP proteázou získanou z komerčního preparátu Gluten Rid with Tolerase G. Nejprve bylo provedeno štěpení AnPEP proteázou za různých podmínek na modelovém proteinu (bovinní karbonická anhydráza 2) a snahou bylo zjistit, jak se při změně podmínek (teploty, pH, koncentrace proteázy na nosiči nebo v roztoku) mění efektivita štěpení a štěpné preference této proteázy. Provedené experimenty ukázaly, že je AnPEP vhodný pro vodík/deuteriovou výměnu spojenou s hmotnostní spektrometrií v imobilizované formě i v roztoku. Naopak méně vhodný je z důvodu...
|
host ::
RSS.