|
|
Strukturní analýza intermediálních filament pomocí chemického zesítění
Dlabolová, Lada ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Proteiny intermediálních filament vytvářejí dynamickou síť cytoskeletálních vláken, která díky svým elastickým vlastnostem výrazně přispívá k odolnosti buněk a tkání vůči mechanickému namáhání. Významným proteinem z rodiny intermediálních filament je vimentin, exprimovaný především v buňkách mezenchymálního původu. Vimentin je spojován s velkým množstvím patofyziologických stavů a současné studie jej považují za klinicky perspektivní cíl pro diagnostiku, prognózu a léčbu širokého spektra chorob od rakoviny po infekční a zánětlivá onemocnění. Přestože z pohledu strukturní charakterizace patří vimentin mezi jeden z nejvíce prozkoumaných proteinů rodiny intermediálních filament, naše znalost je v současné době omezena na strukturu vimentinového tetrameru. V buňkách se vimentin samovolně sestavuje do vláken tvořených homo-oligomerními podjednotkami ULF v procesu, který zahrnuje několik kroků organizace podjednotek. Detailní strukturní charakterizace oligomerních podjednotek vznikajících v průběhu skládání vimentinových vláken je předpokladem k objasnění architektury zralých filament, která může výrazně přispět k pochopení a propojení mechanismů mnoha onemocnění souvisejících se změnami v expresi vimentinu. Tato práce se zaměřuje na strukturní analýzu ULF podjednotek vimentinu vznikajících asociací...
|
|
|
Vliv proteinu 14-3-3 na intradoménové interakce ubiktivin ligasy Nedd4-2
Pohl, Pavel ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Žáková, Lenka (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
CZ Lidská ubikvitin ligasa Nedd4-2 (NEDD4L) ubikvitinuje široké spektrum membránových proteinů a receptorů a hraje tak klíčovou roli v udržování homeostázy organismu. Tento enzym je regulován fosforylací a následnou interakcí s proteiny 14-3-3, čímž je primárně ovlivněna schopnost proteinu Nedd4-2 interagovat s různými substráty. Jen velmi málo je však známo o molekulární podstatě této protein-proteinové interakce. V této práci jsme se zaměřili na biofyzikální charakterizaci úlohy jednotlivých fosforylačních míst a mapování strukturních změn Nedd4-2 způsobených vazbou proteinů 14-3-3. Naše experimenty za užití metod analytické ultracentrifugace odhalily, že k stabilní vazbě proteinu Nedd4-2 na proteiny 14-3-3 je zapotřebí primárně dvou fosforylačních míst Ser342 a Ser448 . Krystalová struktura komplexu 14-3-3ηΔC:Nedd4-2335-455 T367A poté odhalila simultánní vazbu obou fosforylovaných reziduí do vazebného žlábku proteinu 14-3-3. Modelování na základě dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění spojeného s hmotnostní spektrometrií nastínilo rozsáhlé strukturní změny v oblasti jednotlivých domén proteinu Nedd4-2. Vazba proteinu 14-3-3η blokuje doménu WW3 proteinu Nedd4-2 v centrálním kanálu proteinu 14-3-3 a zároveň mění vzájemné pozice domén WW2 a WW4. WW domény Nedd4-2 jsou...
|
|
|
Characterization of protein structures using chemical cross-linking and mass spectrometry.
Kukačka, Zdeněk ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
Některé bílkoviny k plnění své funkce vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru nebo prostetické skupiny. Vazba této specifické molekuly může v molekulách bílkovin způsobit konformační změny. V některých případech může charakterizace takovýchto konformačních změn představovat velmi náročný úkol. V předkládané práci je popsán nový přístup sloužící ke sledování těchto změn pomocí kombinace chemického zesítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Na modelovém systému, kterým byl zvolen protein kalmodulin, je ukázáno, že analýza pomocí izotopově značených síťovacích činidel umožnuje získat přehled o změnách struktury způsobených přítomností nebo nepřítomností ligandu. Byly rovněž popsány potenciální nedostatky metody, které tkví především v nedostatečné proteolýze proteinu. Tato nová metoda, která zároveň umožňuje kvantifikaci strukturních změn proteinů, byla použita spolu s dalšími technikami k charakterizaci neutrální trehalasy Nth1 v komplexu s proteinem Bmh1 (kvasinková forma proteinu 14-3-3). Výsledky odhalily, že vazba proteinu Bmh1 vyvolává přeskupení molekuly Nth1 se změnami především v tzv. "EF-hand" podobném motivu, který je nezbytný pro aktivační proces.
|
|
|
Biofyzikální charakterizace N-koncové části proteinkinasy ASK1.
Honzejková, Karolína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z anglického "apoptosis signal-regulating kinase 1") je apikální kinasa mitogeny aktivované proteinkinasové kaskády (tzv. MAPK kaskády). Její aktivita je spouštěna např. reaktivními formami kyslíku, cytokiny, stresem endoplasmatického retikula či osmotickým stresem. Aktivace ASK1 má za následek spuštění metabolických drah, na jejichž počátcích stojí mitogeny aktivované proteinkinasy (MAPK) p38 a c-Jun N-koncová kinasa (JNK). Aktivace těchto kinas vede k zánětu nebo smrti buňky. Dysregulace ASK1 je asociována s rozvojem patologických stavů, jakými jsou neurodegenerativní, kardiovaskulární či nádorová onemocnění, což z tohoto proteinu činí potenciální cíl terapeutických zásahů. Aktivita proteinkinasy ASK1 je regulována prostřednictvím protein-proteinových interakcí, mezi hlavní negativní regulátory ASK1 řadíme rodinu dimerních proteinů 14-3-3 a redoxní protein thioredoxin 1. Příkladem pozitivních regulátorů jsou faktory asociované s TNF receptorem. Kromě toho je aktivita ASK1 přísně regulována prostřednictvím oligomerizace. Navzdory neustálému pokroku, kterého je dosahováno v rámci studia tohoto proteinu, je přesný molekulární mechanismus regulace ASK1 a vliv oligomerizace na tento proces nejasný, částečně z důvodu nedostatku strukturních dat. Interakce N-koncových částí dvou...
|
|
|
Studium interakce lektinových receptorů přirozených zabíječů s jejich proteinovými ligandy.
Hernychová, Lucie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
NK buňky jsou přirozené lymfocyty, které tvoří díky svému receptorovému systému první linii obrany organismu před infekcemi. Jsou důležitou součástí protivirové, ale také protinádorové imunity, hrají roli v transplantační imunitě, autoimunitě nebo reprodukci. Tato diplomová práce se zabývá studiem struktury membránového receptoru NKR-P1B myších NK buněk a jeho interakcí s ligandem Clr-b. Cílem bylo připravit expresní vektor kódující ligand-vazebnou a celou extracelulární část receptoru NKR-P1B a optimalizovat jeho produkci a renaturaci in vitro. Připravené proteiny byly analyzovány gelovou filtrací, elektroforeticky a hmotnostní spektrometrií. Poté byla sledována jejich interakce s proteinem Clr-b biofyzikálními (gelová filtrace a povrchová plazmonová rezonance) a biologickými metodami (značení buněčných preparátů proteiny NKR-P1B s navázanou fluorescenční sondou). In vitro vazebné pokusy nepotvrdily vzájemnou intarakci NKR-P1B a Clr-b, přestože se připravené proteiny vázaly na buňky z kostní dřeně.
|
|
|
Studium vlivu kofaktoru na strukturu proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Bakteriální protein WrbA z E. coli je zakládajícím členem nové rodiny FMN dependentních NAD(P)H oxidoreduktas, tvořící funkční i strukturní vývojový stupeň mezi bakteriálními flavodoxiny a některými savčími NAD(P)H:chinon oxidoreduktasami. Z těchto důvodů je protein WrbA v poslední době intenzivně studován pomocí různých analytických metod i počítačových simulací. Protein WrbA participuje na ochraně buněk před oxidativním stresem, přesná funkce proteinu WrbA in vivo je však stále neznámá. Protein WrbA tvoří v roztocích multimery, v μM koncentracích se při nízkých teplotách (4 řC) nachází ve formě dimeru, s rostoucí teplotou tetramerizuje. Dostupné trojrozměrné krystalové struktury obsahují informace pouze o tetramerní formě proteinu, dimerní forma dosud nebyla strukturně charakterizována. Tato práce byla zaměřena na studium dynamického chování proteinu v roztoku metodami vodík-deuteriové výměny a chemického síťování s následnou analýzou hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením (FT-ICR). Sledováno bylo chování proteinu v závislosti na vazbě kofaktoru FMN nebo změnách teploty a koncentrace. Analýzou dat z vodík-deuteriové výměny byly získány informace o přístupnosti rozpouštědla a dynamice pro kompletní sekvenci proteinu. Popsán byl stabilizační vliv kofaktoru na tetramerní strukturu proteinu,...
|
|
|
Biofyzikální charakterizace N-koncové části proteinkinasy ASK1.
Honzejková, Karolína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z anglického "apoptosis signal-regulating kinase 1") je apikální kinasa mitogeny aktivované proteinkinasové kaskády (tzv. MAPK kaskády). Její aktivita je spouštěna např. reaktivními formami kyslíku, cytokiny, stresem endoplasmatického retikula či osmotickým stresem. Aktivace ASK1 má za následek spuštění metabolických drah, na jejichž počátcích stojí mitogeny aktivované proteinkinasy (MAPK) p38 a c-Jun N-koncová kinasa (JNK). Aktivace těchto kinas vede k zánětu nebo smrti buňky. Dysregulace ASK1 je asociována s rozvojem patologických stavů, jakými jsou neurodegenerativní, kardiovaskulární či nádorová onemocnění, což z tohoto proteinu činí potenciální cíl terapeutických zásahů. Aktivita proteinkinasy ASK1 je regulována prostřednictvím protein-proteinových interakcí, mezi hlavní negativní regulátory ASK1 řadíme rodinu dimerních proteinů 14-3-3 a redoxní protein thioredoxin 1. Příkladem pozitivních regulátorů jsou faktory asociované s TNF receptorem. Kromě toho je aktivita ASK1 přísně regulována prostřednictvím oligomerizace. Navzdory neustálému pokroku, kterého je dosahováno v rámci studia tohoto proteinu, je přesný molekulární mechanismus regulace ASK1 a vliv oligomerizace na tento proces nejasný, částečně z důvodu nedostatku strukturních dat. Interakce N-koncových částí dvou...
|
|
|
Strukturní charakterizace intracelulární formy myšího Nkr-p1a proteinu.
Vaňková, Pavla ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Kolenko, Petr (oponent)
4 ABSTRAKT NK buňky jsou komponentou přirozeného imunitního systému, která je odvozena od lymfoidního progenitoru. Pomocí sofistikovaného receptorového repertoáru, jež exprimují na svém povrchu, se účastní obrany organismu proti patogenním, virem infikovaným nebo nádorovým buňkám. Současně produkují cytokiny, jejichž prostřednictvím pomáhají spoluutvářet i adaptivní imunitní odpověď. Tato práce je zaměřena na studium struktury rozpustné isoformy myšího receptoru mNkr-p1a, která byla v nedávné době na transkripční úrovni identifikována členem naší laboratoře a nese pracovní označení isoforma 2. Cílem práce bylo vyprodukovat protein mNkr-p1a iso2 v prokaryotickém expresním systému a provést jeho renaturaci a purifikaci in vitro. V další fázi byl získaný produkt analyzován metodami hmotnostní spektrometrie. Jí získané výsledky nás ovšem dovedly k určitým pochybnostem, zda náš protein v roztoku nabývá definovanou 3D strukturu a nejedná se pouze o artefakt. To bylo vyvráceno dalšími biofyzikálními metodami, nukleární magnetickou rezonancí a měřením cirkulárního dichroismu a dynamického rozptylu světla. Klíčová slova: NK buňky Receptor mNkr - p1a Krátká isoforma mNkr - p1a iso2 Alternativní sestřih Biosyntéza proteinů Produkce rekombinantních proteinů Purifikace proteinů Hmotnostní spektrometrie Disulfidové vazby...
|
|
|
Aplikační potenciál modifikačních metod (chemická činidla, foto-nanosondy) a hmotnostní spektrometrie pro studium struktury proteinů a jejich vzájemných interakcí
Ptáčková, Renata ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Levová, Kateřina (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
K pochopení fyziologické funkce proteinů je nezbytná znalost jejich prostorového uspořádání, studium konformačních změn a vzájemných interakcí. Chemické zesítění v kombinaci s hmotnostní spektrometrií představuje vhodnou doplňkovou techniku k běžným metodám strukturní biologie (RTG krystalografie, NMR spektroskopie), která umožňuje charakterizovat interakce v komplexech bílkovin za nativních podmínek. Předkládaná práce je zaměřena především na novou síťovací techniku založenou na in vivo inkorporaci analogu methioninu s foto-reaktivní funkční skupinou (foto-Met) do sekvence studovaného proteinu (tzv. proteinová foto-nanosonda). Interakce modelové dimerní molekuly proteinu 14-3-3zeta byla použita pro testování a optimalizaci přípravy proteinové foto-nanosondy a byla tak ověřena využitelnost této techniky k zachycení protein-proteinových interakcí. Byla řešena také interakce membránových hemoproteinů - cytochromu P450 2B4 a cytochromu b5. S využitím chemického zesítění a MS analýzy byla charakterizována vzájemná interakce katalytických domén cytochromů a byly nalezeny dvě možné prostorové orientace cytochromů. Nově zavedená technika síťování pomocí foto-Met umožnila zachytit různé oligomerní stavy katalyticky aktivního membránového komplexu a byl stanoven molární poměr cytochromů v identifikovaných...
|
|
|
Characterization of protein structures using chemical cross-linking and mass spectrometry.
Kukačka, Zdeněk ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
Některé bílkoviny k plnění své funkce vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru nebo prostetické skupiny. Vazba této specifické molekuly může v molekulách bílkovin způsobit konformační změny. V některých případech může charakterizace takovýchto konformačních změn představovat velmi náročný úkol. V předkládané práci je popsán nový přístup sloužící ke sledování těchto změn pomocí kombinace chemického zesítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Na modelovém systému, kterým byl zvolen protein kalmodulin, je ukázáno, že analýza pomocí izotopově značených síťovacích činidel umožnuje získat přehled o změnách struktury způsobených přítomností nebo nepřítomností ligandu. Byly rovněž popsány potenciální nedostatky metody, které tkví především v nedostatečné proteolýze proteinu. Tato nová metoda, která zároveň umožňuje kvantifikaci strukturních změn proteinů, byla použita spolu s dalšími technikami k charakterizaci neutrální trehalasy Nth1 v komplexu s proteinem Bmh1 (kvasinková forma proteinu 14-3-3). Výsledky odhalily, že vazba proteinu Bmh1 vyvolává přeskupení molekuly Nth1 se změnami především v tzv. "EF-hand" podobném motivu, který je nezbytný pro aktivační proces.
|
host ::
RSS.