|
|
Vnitřní fluorescence bakterií Cupriavidus necator
Marková, Kateřina ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá autofluorescencí flavinů v gram-negativní bakterii Cupriavidus necator H16 a jejím mutantním kmenu PHB-4. Experimenty byly prováděny pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie. Pro potvrzení přítomnosti flavinů byla změřena excitační a emisní spektra bakteriální suspenze, která se porovnala s flavinovými standardy. V části věnované testování buněk bez stresové odpovědi se měřila autofluorescence bakterií v PBS pufru a buněčné suspenze obarvené fluorescenční sondou BODIPY 493/503. Byl porovnáván poměr krátké doby života ku dlouhé době života autofluorescence a jeho závislost na přítomnosti fluorescenční sondy. Dále byla měřena autofluorescence supernatantu, kdy bylo zjištěno, že relativní zastoupení dlouhé doby života v extracelulárním prostředí je mnohonásobně vyšší než v intracelulárním. V části věnované stresové odpovědi se práce zaměřila na množství rozpuštěného kyslíku v produkčním médiu. Dále byl použit různě koncentrovaný peroxid vodíku, kdy nejlepší výsledky vykazovala koncentrace 100 mM. Pro porovnání s předchozími podmínkami se využila kombinace se síranem železnato-amonným, kde ale nebyl pozorován žádný rozdíl. Z látek ovlivňujících přímo dýchací řetězec byl použit azid sodný a antimycin A. Obě tyto látky měly vliv na změnu poměru relativního zastoupení dob života autofluorescence, ovšem rozložení těchto dob života a změnu rozložení autofluorescence v průběhu času ovlivňoval pouze azid sodný.
|
|
|
Aflatoxiny v potravinách a jejich vliv na DNA a buněčné linie
Šislerová, Lucie ; Pernicová, Iva (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Aflatoxiny představují kvůli jejich vysoké toxicitě a karcinogenitě velké nebezpečí, kterému se v běžném životě snadno nevyhneme. Intoxikace aflatoxiny způsobuje velkou řadu onemocnění od těch lehčích až po nekrózu orgánů či smrt. Nejvíce aflatoxiny postihují játra, kde dochází k jejich odbourávání a vzniku následných metabolitů, které jsou pro tělo nejtoxičtější. Z tohoto důvodu je jejich přesné stanovení a porozumění principu jejich účinků velmi důležité. V práci byly kalibrovány metody pro sledování a k bližšímu určení vlivu aflatoxinů na lidské buňky. K tomuto sledování byly použity metody: MTT testy viability, fluorescenční mikroskopie a průtoková cytometrie. Jako další bylo proměřeno množství přítomných aflatoxinů v různých potravinách s odlišnými podmínkami skladování. Pro tuto analýzu byly použity ELISA testy RIDASCREEN Aflatoxin Total a RIDA Aflatoxin column. Kalibrované metody byly porovnány s metodami již používanými pro stanovení vlivu aflatoxinů a výsledky ELISA testů byly porovnány s limity množství aflatoxinů povolenými Českou legislativou. Žádná z kontrolovaných potravin neobsahovala nadlimitní koncentraci aflatoxinů, která je v České republice stanovena na 4-10 µg/l (liší se pro různé druhy potravin). Nejvyšší hodnoty aflatoxinů vykazovaly potraviny, které byly špatně skladovány ale nebyly viditelně napadeny plísněmi. Byla stanovena hodnota LD50 pro aflatoxin B1 na 12,25 µM. Pomocí průtokové cytometrie byl stanoven druh buněčné smrti, kterou aflatoxin způsobil a tato data byla dále potvrzena díky snímkům z fluorescenční mikroskopie.
|
|
|
Evoluční inženýrství cyanobakterií v kontextu akumulace PHA
Vašířová, Kristýna ; Slaninová, Eva (oponent) ; Samek, Ota (vedoucí práce)
Cílem této diplomové práce bylo podrobit vybrané cyanobakteriální kmeny adaptivní evoluci a následně prozkoumat vlastnosti vzniklých adaptovaných kmenů, obzvlášť jejich změny týkající se akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Teoretická část práce blíže charakterizuje problematiku cyanobakterií, PHA a jejich vzájemné propojení v oblasti evolučního inženýrství. Pro evoluční experimenty byly použity cyanobakteriální kmeny Synechocystis sp. PCC 6803 a Synechocystis salina CCALA 192. Na vybrané zástupce byly vyvíjeny selekční tlaky působením peroxidu vodíku a mědi. Vzniklé kultury a jejich schopnost akumulace PHA byly následně posouzeny metodou plynové chromatografie. Oba tyto zvolené selekční tlaky se ukázaly jako nevhodné, jelikož po jejich aplikaci na kultury byla pozorována vysoká inhibice růstu neumožňující aplikace metod evolučního inženýrství. V druhé půlce experimentální části byly sledovány poskytnuté adaptované kmeny na 6% NaCl. Prokázalo se, že adaptace má na mikroorganismy pozitivní vliv, jelikož vykazovaly lepší růst biomasy, vyšší odolnost při odolávání stresovým podmínkám a bylo pozorováno nepatrné navýšení akumulace PHA.
|
|
|
Charakterizace adsorbčních vlastností probiotických bakterií
Černá, Klára ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem diplomové práce je charakterizace adsorbčních vlastností probiotických bakterií. Charakterizace byla provedena pomocí navržené a zoptimalizované spektrofotometrické metody stanovení adheze probiotických bakterií k mucinu, jakožto hlavní viskoelastické složce hlenu, která byla nedílnou součástí experimentální části práce. Za účelem detailnějšího popisu adhezních interakcí, podílejících se na adhezi probiotických bakterií k mucinu, byla stanovena pomocí průtokové cytometrie viabilita vybraných probiotických bakteriálních kmenů: Lactobacillus rhamnosus CCM 1825, Lactobacillus plantarum CCM 7039, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CCM 7190, Lactobacillus acidophilus CCM 4833, Lactobacillus casei CCM 4798, Bifidobacterium breve CCM 7825, Bacillus coagulans CCM 2658 a potencionálního probiotického kmene Lactobacillus zeae CCM 7069. U zmíněných bakterií byl také stanoven hydrofobní efekt pomocí BATH (bakteriální adheze k uhlovodikům) experimentu. Poslední navrženou a zoptimalizovanou technikou byl dynamický a elektroforetický rozptyl světla charakterizující povrchové vlastnosti jako -potenciál, průměrná distribuce velikosti a izoelektrický bod. Z této metody byly získány informace o agregaci bakteriálních buněk a o elektrostatických interakcích. Kombinací těchto metod byla charakterizována adheze, jako velmi specifický, senzitivní a klíčový parametr úspěšného probiotického mikroorganismu, který je ovlivňován rozličnými vlivy.
|
|
|
Souvislost mezi schopností bakterií odolávat teplotnímu stresu a akumulovat PHA
Nováčková, Ivana ; Benešová, Pavla (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá zapojením polyhydroxyalkanoátů (PHA) do stresové odpovědi bakterií, a to konkrétně při působení teplotního stresu. Teoretická část práce se zaměřuje na stresovou odpověď bakterií obecně, na mechanismus odpovědi vůči teplotnímu stresu a na zapojení PHA do stresové odpovědi. V rámci experimentální práce byla zkoumána souvislost mezi množstvím PHA v biomase bakterií a jejich viabilitě po působení teplotního stresu. Pro práci byly využity PHA produkující kmeny Cupriavidus necator H16, Burkholderia cepacia a Burkholderia sacchari a PHA neprodukující mutantní kmen Cupriavidus necator PHB4. Bakterie akumulovaly poly(3-hydroxybutyrát) (PHB), přičemž jeho množství v biomase bylo stanovováno pomocí plynové chromatografie s FID. Viabilita živých bakteriálních buněk i buněk po expozici teplotním stresům byla stanovována pomocí průtokové cytometrie. Ukázalo se, že obsah PHB v biomase napomáhal bakteriím odolávat mrazovému šoku. Na základě porovnání viability bakterií C. necator H16 a C. necator PHB4 po expozici kombinovaným stresům bylo rovněž pozorováno, že PHB zvyšoval odolnost buněk vůči teplotnímu stresu a stresu způsobenému nízkým pH.
|
|
|
Probiotika a prebiotika - studium účinků, interakcí a možností koenkapsulace
Vrtná, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na enkapsulaci probiotik a testování možností koenkapsulace s některými typy prebiotik. Teoretická část se zabývá probiotiky, jejich obecnou charakterizací a možností využití probiotických kultur ať už v potravinářském průmyslu jako doplňky stravy nebo v kosmetickém průmyslu. Dále jsou popsány prebiotika a jejich rozdělení, proces enkapsulace a jednotlivé techniky enkapsulace. V této části jsou také popsány vybrané metody, které byly využívány k analýze částic a enkapsulovaných složek. V experimentální části byla nejprve provedena charakterizace zvolených prebiotik, a to pomocí spektrofotometrických metod, tenkovrstevné chromatografie a vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Následně byla testována možnost kultivace probiotik s přídavkem prebiotika v nehydrolyzované i hydrolyzované formě. S využitím průtokového cytometru byla stanovená rovněž viabilita buněk. Na závěr byly probiotika společně s prebiotiky enkapsulovány do alginátových částic s využitím enkapsulátoru a po dobu 6 týdnů byla sledována jejcih dlouhodobá stabilita v modelovém prostředí. Částice byly také vystaveny působení umělé pankreatické, žaludeční a žlučové šťávy.
|
|
|
Studium karotenogenních kvasinek v průběhu růstu pomocí pokročilých instrumentálních technik
Vaněk, Martin ; Breierová, Emília (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá využitím pokročilých fluorescenčních technik při získávání poznatků o průběhu kultivace karotenogenních kvasinek. Zkoumá možnosti průtokové cytometrie při měření autofluorescence a kvantifikaci karotenoidů. Ukázalo se, že dokud jsou karotenoidy ukládány do membránových struktur, je metoda použitelná. Ovšem v průběhu stacionární fáze karotenogenní kvasinky vždy začnou ukládat karotenoidy i do lipidických granulí, a tehdy metoda selhává. Dále byly zkoumány možnosti průtokové cytometrie pro stanovení velikosti buněk a obsahu lipidů. Dokud buňky nehladoví, tedy není vyčerpán substrát v médiu, tak tato měření vysoce korelují s obsahem lipidů dle plynové chromatografie. Nutností je ovšem sestrojení kalibrace pro každý kvasničný druh zvlášť, aby byla vystižena specifika vnitrobuněčné stavby. Další zkoumanou metodou byla fluorescenční mikroskopie se schopností časově rozlišené detekce, umožňující ve vzorku pozorovat odlišné spécie téže sloučeniny, v závislosti na rozdílných prostředích, ve kterých se nachází. Pomocí této metody byly pozorovány a kvantifikovány změny buněčných lipidických struktur (membrán, lipidických granulí) a nalezeny souvislosti s přizpůsobováním se podmínkám prostředí. Zvyšování koncentrace karotenoidů a/nebo zvýšení rigidity membrán dochází tehdy, když buňka přechází z jednoho růstového a metabolického stádia do druhého a potřebuje chránit intracelulární obsah během takové změny.
|
|
|
Probiotika a prebiotika a možnosti jejich koenkapsulace
Šnajdarová, Karolína ; Bokrová, Jitka (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem probiotických kultur a možností jejich koenkapsulace se specifickými substráty, tzn. prebiotiky. Enkapsulovanými organismy byly Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium breve. Jejich specifickými substráty byly inulin, psyllium, jablečná vláknina a konopná vláknina. Prebotika byla k buňkám přidávána buď nehydrolyzovaná, anebo upravená hydrolýzou. U částic byla mikroskopicky sledována dlouhodobá stabilita po dobu 6 týdnů v prostředí 2,5% kyseliny citrónové. Jako nejlepší substrát pro růst buněk byla shledána konopná vláknina, na níž byl zaznamenán celkově nejvyšší nárůst buněk v částicích. Částice s přídavkem konopné vlákniny se v modelovém prostředí lidského organismu navíc rozpadaly až pod vlivem střevních šťáv, mohly by být proto využity v potravinových doplňcích s cíleným transportem do střeva. Práce se také soustředila na charakterizaci obsahových složek prebiotik. Nejvyšší obsah celkových sacharidů byl zaznamenán pro nehydrolyzovaná prebiotika, zejména psyllium. Nejvyšší obsah redukujících sacharidů ve skupině nehydrolyzovaných i hydrolyzovaných prebiotik měla konopná vláknina. Metodou tenkovrstvé chromatografie bylo zjištěno, že hlavními složkami hydrolyzovaných prebiotik jsou glukóza a fruktóza, další obsahové složky tvoří disacharidy a oligosacharidy. Pro charakterizaci prebiotik pomocí HPLC se osvědčila kolona Rezex díky své větší citlivosti. Zde bylo potvrzeno, že hlavní část hydrolyzovaných prebiotik tvoří glukóza a fruktóza, zbytek tvoří malé množství složitějších sacharidů.
|
|
|
Využití mikroskopie a průtokové cytometrie ke stanovení molekulárních charakteristik karotenogenních kvasinek
Vacková, Hana ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Cílem práce bylo optimalizovat metody pro studium kvasinek s využitím průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. V teoretické části se pojednává o struktuře buněk kvasinek, o principech a využití průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. Byla též zpracována rešerše na téma využití mikroskopie a průtokové cytometrie u pigmentovaných mikroorganismů. V experimentální části byla provedena optimalizace metod na kvasinkách Cystofilibasidium capitatum, Rhodotorula glutinis, Sporobolomyces roseus a Sporobolomyces shibatanus. Dále byla měřena růstová křivka a životaschopnost kvasinek při působení teplotního stresu - mražení a teplotního šoku 60 °C. Bylo prokázáno, že Cystofilobasidium capitatum je vůči stresu odolnější než Rhodotorula glutinis. Dále byla zjištěna možnost použití methylenové modři namísto propidium jodidu k analýze buněk průtokovou cytometrií.
|
|
|
Využití vybraných fluorescenčních technik ke studiu kvasinek a jejich metabolitů
Mikheichyk, Nadzeya ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Cílem práce byla optimalizace metod pro studium kvasinek a jejich metabolitů s využitím průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. Červené kvasinky jsou charakteristické nadprodukcí karotenoidů a lipidů, které jsou využívané v potravinářském, farmaceutickém a krmivářském průmyslu. V současnosti se intenzivně zkoumají vhodné mikrobiologické alternativy pro produkci těchto látek. V této práci byly zkoumány vybrané kvasinkové rody: Rhodotorula, Sporobolomyces, Cystofilobasidium a kmen Phaffia rhodozyma. Kvasinky byly kultivovány na různých živných médiích, kde byla jako nutriční zdroj použita glukóza a dále také na vybraných odpadních materiálech glycerolu a syrovátce. U dvou kmenů Cystofilobasidium macerans a Rhodotorula mucilaginosa byly stanoveny růstové charakteristiky na syntetickém glukózovém produkčním médiu. Všechny studované kmeny byly schopny využívat použité odpadní substráty jako zdroj živin. U části kmenů byla pozorována zvýšená produkce karotenoidů, a v některých případech byla doprovázena i relativně vysokou produkcí lipidů. U klasické kultivace nejlepší produkční vlastnosti projevil kmen Rhodotorula glutinis v lipidovém a v glukózovém médiu s přídavkem vitaminů. Na glycerolu nejvíce karotenoidů a lipidických látek produkoval kmen Sporobolomyces shibatanus. Kmen Sporobolomyces roseus projevil nejlepší produkční vlastnosti na syrovátce, jako hlavním zdroji uhlíku. Z výsledků vyplývá, že využití syrovátky a glycerolu se jeví jako vhodná varianta možného zdroje uhlíku ke kultivaci karotenogenních kvasinek a produkci karotenoidů a vybraných lipidických látek jakožto produktů s vyšší přidanou hodnotou. Bude ale nutné dále optimalizovat živné médium na daných substrátech pro větší produkci vybraných metabolitů. Fluorescenční mikroskopie a průtokový cytometrie se ukázaly jako vhodné varianty pro stanovení obsahu sledovaných metabolitů v buňkách, jejich množství a viability.
|
host ::
RSS.