|
|
CRISPR/Cas genome editing in human disease models and the translation into therapies
Faltínová, Pavlína ; Krupková, Michaela (vedoucí práce) ; Šedová, Lucie (oponent)
Vzácná onemocnění, jak už jejich název napovídá, individuálně postihují jen malý počet lidí na celém světě. Vzhledem k jejich nízké prevalenci je nalezení vhodné terapie velmi obtížné. Neuspokojivé pochopení molekulárních příčin a mechanismů, které je provázejí, a nemožnost provádět klinické studie v obvyklém rozsahu v důsledku nízkého výskytu vzácných onemocnění patří k hlavním problémům, které zbržďují vývoj vhodné léčby. Tvorba myších modelů je slibnou cestou k vyřešení těchto obtíží, neboť myši mají řadu vlastností nezbytných pro modelování lidských onemocnění. CRISPR/Cas9 umožňuje vědcům provádět přesné změny v genomu pomocí nukleázy Cas9, která vytváří dvouřetězcové zlomy v DNA poté, co ji speciálně navržená guide RNA přivede k místu zájmu. Pokud je sekvence zvoleného místa známá, lze možné úpravy zavést téměř kamkoliv do genomu a jejich repertoár je navíc prakticky nekonečný. Využití CRISPR/Cas9 technologie se ukázalo být ideální pro tvorbu myších modelů vzácných onemocnění, neboť většina těchto poruch je způsobena genetickými mutacemi, které dokáže tato metoda plně napodobit. Tato práce se zaměřuje na strategie využívané při tvorbě myších modelů pomocí systému CRISPR/Cas9 a shrnuje jejich podrobné mechanismy. Klíčová slova: vzácná onemocnění, myší model, CRISPR/Cas9, knock-out,...
|
|
|
Role řízené tkáňově-specifcké produkce ISWI proteinu Smarca5/Snf2h v myší krvetvorbě.
Turková, Tereza ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Forejt, Jiří (oponent) ; Mráz, Marek (oponent)
Proces diferenciace krvetvorných buněk je závislý na chromatin-remodelační aktivitě ISWI ATPázy SMARCA5 (SNF2H) a jejích komplexů. Pro studium funkcí této ATPázy jsme v naší laboratoři vyvinuli řadu myších modelů, počínaje modelem s konstitutivní delecí genu Smarca5 a na něj navazujícími modely s kondicionální delecí tohoto genu v závislosti na tkáňově specificky exprimované Cre rekombináze (zejména v různých stádiích krvetvorby). Závažnost fenotypových projevů u myších modelů se různí od brzké embryonální letality konstitutivního delečního modelu, přes fetální letalitu spojenou se selháním erytropoézy (Vav1iCre model - delece v definitivním hematopoetickém progenitoru) až po poruchy lymfopoézy neomezující přežití zvířat (hCD2iCre model - delece v T a B lymfocytech) u kondicionálně delečních modelů. Tato práce navazuje na pozorování získaná při studiu delečních modelů genu Smarca5, tedy že delece vede k zástavě dělení buněk a jejich vstupu do apoptózy. Defekty byly pozorovány už ve stádiu kmenových buněk a hematopoetických progenitorů, které nebyly schopné vstoupit do procesu diferenciace v nepřítomnosti SMARCA5 proteinu. V těchto modelech kvůli tomu nebylo možné studovat průběh diferenciace. Proto jsme se rozhodli vytvořit nový myší model s hypomorfní (exprimující nižší množství proteinu)...
|
|
|
Mouse models for Angelman syndrome: generation and characterization
Syding, Linn Amanda ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Valeš, Karel (oponent)
Angelmanův syndrom (AS) je neurovývojové onemocnění s celosvětovou incidencí 1:10 000, vyskytuje se tedy u 40 000 porodů ročně, poměr mezi pohlavími je stejný. Mezi klíčové charakteristiky onemocnění patří ataktická chůze s třesem, těžká mentální retardace, těžké poruchy řeči a záchvaty. U postižených jedinců se také vyskytují behaviorální deficity, jako je zvýšená úzkost a poruchy autistického spektra. Onemocnění pochází z imprintované oblasti 15q11.2-13q, kde jsou geny exprimovány buď maternálně, nebo paternálně jako výsledek exprese alel specifické pro rodiče. Existují čtyři hlavní genetické mutace způsobující AS, a to i) velká delece v rozsahu 4- 6 Mb na alele zděděné maternálně včetně imprintovaných a bialelicky exprimovaných genů, ii) delece maternálního původu v genu Ubitiquin ligázy E3 (UBE3A), iii) paternální uniparentální disomie a iv) defekt imprintingu vedoucí k nevhodné metylaci lokusu. Dosud neexistuje žádný lék na AS, spíše se symptomy zmírňují pomocí multidisciplinárního přístupu. Cílem doktorského studia bylo dále dešifrovat roli UBE 3A a GABRA5 pomocí dvou myších modelů s cílem získat více znalostí o zapojení těchto dvou genů do generování modelů pro budoucí terapeutické intervence. Jedním vytvořeným modelem byla úplná genová delece Ube3a z 5'UTR do 3'UTR zahrnující přibližně 76...
|
|
|
Emotional transition and nonstructural changes in mouse models of autism
Nováková, Rozálie ; Kubik-Zahorodna, Agnieszka (vedoucí práce) ; Bendová, Zdeňka (oponent)
Poruchy autistického spektra jsou skupinou neurovývojových poruch, které se projevují stereotypním chováním a poruchou v sociálním chování a komunikaci. Celková etologická heterogenita zatím stále nebyla plně objasněna. Je proto žádoucí se zaměřit na experimentální výzkum, zejména s využitím animálních modelů, s jejichž pomocí lze vyvíjet léčiva či hledat cesty k plnému uzdravení. V této práci proto navrhuji novou modifikaci testu pro evaluaci přenosu emoční informace mezi myšmi, která by znatelně rozšířila množství informace o sociálním chování myší získaném behaviorálními testy. Protokol podobného testu byl již nedávno publikován, nicméně se zatím stále ještě nezařadil do baterie běžných behaviorálních testů pro myši. Výsledky potvrzují možnost měření přenosu strachu mezi myšmi, ovšem pouze během jejich přímé komunikace s pomocí etologické evaluace a nikoli následovně skrze standardizovaný test měřící úroveň úzkosti. Self-grooming, tedy péče o srst, se ukázala být jediným etologickým parametrem natolik citlivým, aby ukázal signifikantní rozdíl mezi stresovanou a kontrolní skupinou, může být proto považován za nejvhodnější parametr pro danou evaluaci. Nicméně, statistické výsledky byly značně ovlivněné vysokou variabilitou individuálního chování jednotlivých myší. Behaviorální test přenosu emoční...
|
|
|
Immune stimulation by lipid nanoparticles
Aulichová, Veronika ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Pačesová, Andrea (oponent)
Lipidické nanočástice představují nejvyspělejší nevirový transportní systém pro nukleové kyseliny. Umožňují bezpečný a účinný transport nukleových kyselin do cílových buněk a jsou zcela klíčovou technologií pro RNA terapeutika. Ta představují rychle se rozvíjející oblast genetické medicíny, avšak vzhledem k povaze molekuly RNA a především její náchylnosti k degradaci nukleázami, je transportní systém naprosto zásadní pro přechod RNA terapeutik do klinické praxe. Tato práce zkoumá schopnost mRNA formulované v lipidických nanočásticích založených na ionizovatelném lipidoidu zvaným XMAN6 produkovat antigen in vivo a vyvolat tím protilátkovou odpověď. XMAN6 je lipidoid z nové třídy ionizovatelných lipidoidů na bázi adamantanu vyvinutých naším týmem. Lipidické nanočástice byly nejprve testovány in vitro za účelem analýzy jejich funkčnosti a indukce cytokinů, a poté in vivo za použití myšího modelu. Lipidické nanočástice byly aplikovány dvěma různými způsoby a v několika experimentálních modelech a jejich bezpečnost byla hodnocena analýzou celkové myší aktivity. Data ukázala, že XMAN6 je slibný lipidoid pro in vivo použití. Lipidické nanočástice, založené na XMAN6, úspěšně indukovaly protilátkovou odpověď proti antigenu kódovanému dopravenou mRNA, a to jak po intraperitoneální, tak po intramuskulární...
|
|
|
Výzkum epigenetických aspektů kmenových buněk krvetvorby a spermatogeneze.
Hybešová, Michaela ; Pimková, Kristýna (vedoucí práce) ; Děd, Lukáš (oponent)
Diferenciace kmenových buněk je řízená koordinovanou regulací genové transkripce. Jedním z regulačních faktorů je rozvolnění chromatinu a zpřístupnění DNA k transkripčním faktorům. Remodelace chromatinu je zajišťována remodelačními komplexy. ISWI chromatin remodelující ATPáza Smarca5 (S5) je významným faktorem remodelačních komplexů. Jedná se o vysoce konzervovaný chromatin-remodelační faktor, který se nachází v několika komplexech oligopodjednotek a tvoří zde katalytickou podjednotku. V těchto komplexech aktivně reguluje strukturu a přestavbu nukleozomu během replikace, oprav a transkripce DNA. Bylo zjištěno, že S5 je klíčový protein pro embryonální vývoj. Jeho nedostatek vede k poruchám krvetvorby a vývoji samčích pohlavních orgánů. V této práci jsme se zaměřili na roli S5 v hematopoéze a spermatogenezi. Pomocí myšího modelu s transgenní expresí S5, ko-imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie jsme identifikovali komplexy, v nichž se S5 nachází v hematopoetických orgánech a v buňkách v testes. Studovali jsme také fenotypové následky deficitu S5 v myších testes a zjistili, že vede k poruše vývoje spermií a samčí sterilitě. Pomocí transkriptomické a proteomické analýzy jsme identifikovali, některé molekulární programy, které by mohly k poruchám reprodukce vést. Naše práce naznačuje, že S5 je...
|
|
|
Poruchy kmenových buněk v myším modelu Diamondovy-Blackfanovy anémie
Holečková, Markéta ; Kokavec, Juraj (vedoucí práce) ; Valášek, Leoš (oponent)
Diamondova-Blackfanova anémie (DBA) je vzácné vrozené onemocnění kostní dřeně, které je charakterizováno poruchami ve vývoji erytrocytů a bývá doprovázena širokou škálou jiných defektů. Je způsobena mutací v některém z genů ribozomálních proteinů, ve čtvrtině všech případů se jedná o gen RPS19. Mechanismus vzniku patologie této nemoci není dosud přesně znám. Pro lepší porozumění vztahu genotypu a fenotypu u DBA byl vytvořen myší model s homozygotní mutací vysoce konzervovaného argininu 67 (Rps19R67Δ/R67Δ ). Myší model s touto mutací vykazuje mnoho fenotypových příznaků odpovídajících těm, kterými trpí pacienti s DBA. V této diplomové práci se zaměřujeme na charakterizaci hematopoetických a erytropoetických vlastností tohoto myšího modelu. Prokázali jsme, že myši trpí anémií a k poruchám erytropoézy dochází ve stádiu proerytroblastů. V hematopoéze jsme pozorovali změny již od stádia multipotentních progenitorů. Role proteinu p53 v patogenezi DBA je již dlouho známá. Pracovali jsme proto i s modelem Rps19R67Δ/R67Δ Trp53-/- , na kterém jsme pozorovali záchranu fenotypu. Erytropoéza ani hematopoéza nebyla u tohoto myšího modelu narušena. Pomocí transkriptomické analýzy jsme prokázali, že u Rps19R67Δ/R67Δ myší dochází ke zvýšené expresi několika genů, které jsou všechny součástí p53 signální dráhy,...
|
|
|
Vliv NEUROD1 transkripční regulace na vývoj a funkci neuronů vnitřního ucha
Merc, Veronika ; Pavlínková, Gabriela (vedoucí práce) ; Mašek, Jan (oponent)
Identifikace a pochopení funkce transkripčních faktorů zapojených v komplexní síti regulující vývoj neurosenzorických buněk vnitřního ucha je klíčovým bodem pro pochopení patofyziologie ztráty sluchu a rozvoj nových terapeutických nástrojů pro neurosenzorickou regenerační terapii a prevenci. Cílem předložené práce bylo objasnit funkci transkripčního faktoru NEUROD1 ve vývoji vnitřního ucha a senzorických neuronů. Pomocí rekombinačního systému Cre-loxP byl vytvořen unikátní myší model s tkáňově specifickou delecí Neurod1 v NEUROD1-Cre exprimujících buňkách (Neurod1ST). Ve vnitřním uchu byl Neurod1 eliminován pouze v neuronech, což umožnilo zhodnotit sekundární účinky Neurod1 delece na vývoj senzorického epitelu. Ukázali jsme, že časný vývoj vnitřního ucha ani formace statoakustického ganglia nebyla delecí Neurod1 významně ovlivněna. Primární důsledek Neurod1 delece se projevil zvýšeným odumíráním neuronů v důsledku apoptózy, což vedlo k defektům během formace spirálního ganglia a růstu kochleární inervace. Spirální a vestibulární ganglia byly u mutantů menší a na jejich rozmezí se nacházelo množství neuronů, což ukazuje na jejich narušenou migraci a segregaci. Senzorický epitel kochley byl zkrácen pravděpodobně v důsledku sníženého množství neuronů uvnitř spirálního ganglia. Rovněž jsme zaznamenali...
|
|
|
Genotype influence on development of infections caused by Trypanosomatidae in mouse
Šíma, Matyáš ; Lipoldová, Marie (vedoucí práce) ; Krulová, Magdaléna (oponent) ; Kolářová, Iva (oponent)
Parazitičtí prvoci rodu Trypanosoma a Leishmania jsou členi čeledi Trypanosomatidae. V naší práci jsme na myším modelu zkoumali vliv genotypu na infekce způsobené těmito parazity. Tato onemocnění jsou na genetické úrovni řízena lokusy kvantitativních vlastností (QTL), kdy výsledný fenotyp je řízen množinou genů s malým individuálním účinkem. Jako myší model pro mapování QTL, které kontrolují tyto infekce, jsme použili rekombinantní kongenní kmeny (RCS). Každý RCS nese jedinečnou kombinaci 12,5% genomu rodičovského kmene dárce na genetickém pozadí druhého rodičovského kmene. Pro mapování QTL kontrolujících infekce Trypanosoma brucei brucei (T. b. brucei) a Leishmania tropica (L. tropica) a infiltraci eosinofilů do inguinálních uzlin po infekci Leishmania major (L. major) jsme použili RCS z řady CcS/Dem, kde STS je kmen dárce a BALB/cHeA je kmen genetického pozadí. Nejprve bylo nutné najít pro mapování vhodné modelové kmeny. Ve všech třech studiích jsme zvolili RCS, který překročil rozsah monitorovaných parametrů fenotypu ve srovnání s jinými testovanými RCS i rodičovskými kmeny. Myši RCS CcS-11 vykazovaly kratší přežití po infekci T. b. brucei a myši kmene CcS-9 vykazovaly vyšší infiltraci eosinofilů po infekci L. major. Pro analýzu genetické kontroly vnímavosti k L. tropica jsme vybrali samice kmene CcS-16,...
|
|
|
Deciphering the biological role of Ddi1-like protein family
Sivá, Monika ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Stopka, Pavel (oponent)
Představitelé rodiny proteinů podobných Ddi1 (z angl. DNA damage-inducible protein homolog 1) patří do skupiny tzv. "přenašečů", které jsou v buňce zodpovědné za regulaci degradace proteinů v ubikvitin-proteasomálním systému. Proteiny podobné Ddi1 se od ostatních přenašečů liší specifickou doménou podobnou retrovirálním proteasam, která patří mezi aspartové proteasy. Nedávno byla v jejich struktuře taktéž objevena vysoce konservovaná helikální doména. V poslední době se objevují studie, které popisují nové funkce členů rodiny protein podobných Ddi1 a to v rámci udržování buněčné homeostázy v odpovědi na stresové podněty, např. v reakci na proteotoxické podmínky nebo v opravě poškozené DNA. Tato disertační práce se zabývá charakterizací vybraných členů rodiny proteinů podobných Ddi1 a to jak na molekulární úrovni, tak v biologických studiích na myších modelech. Byla vyřešena struktura domény podobné ubikvitinu (ubiquitin-like domain, UBL) v rámci kvasinkového proteinu Ddi1. Následně byly porovnány vazebné vlastnosti domén UBL kvasinkového proteinu Ddi1 a lidského proteinu DDI2. Doména UBL a motiv vázající ubikvitin (ubiquitin interacting motif, UIM) lidského homologu DDI2 sice specificky vážou ubikvitin, zároveň je však tato vazba velice slabáv porovnání s jinými ubikvitin vazebnými doménami. Naše...
|
host ::
RSS.