|
|
Analysis of mutual interactions of the human multifactor complex components in translation initiation
Prilepskaja, Terezie ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Demo, Gabriel (oponent) ; Mašek, Tomáš (oponent)
Hlavním úkolem eukaryotické iniciace translace je rozpoznání správného start kodonu. Start kodon určuje nejen pozici, z které je zahájená translace proteinu, ale rovněž čtecí rámec, ve kterém je dekodována sekvence proteinu. Přesnost rozeznání start kodonu je řízena pomocí iniciačních faktorů a jejich vzájemnými interakcemi. Jeden z nich, největší, je nazýván eukaryotická iniciační factor 3 (eIF3). Přesný mechanismus, jakým eIF3 ovlivňuje přesnost rozpoznání start kodonu není známý. Zde jsme pomocí CryoEM, formaldehydem zasítěných gradientů a řady biochemických metod objasnila vliv jednotlivých lidských eIF3 podjednotek na tento komplikovaný proces. Moje práce a práce našich spolupracovníků zejména ukázala, že eIF3d podporuje vazbu eIF3 na ribozom na začátku iniciace translace a že minimalistický eIF3 subkomplex (YLC- komplex podobný kavasinkovému eIF3) má zachované základní funkce eIF3 jako je sestavení 43S preiniciačního komplexu a navázání mRNA. Další studie ukázala, že lidské eIF3c je zapojeno do vylaďování přesnosti rozeznání start kodonu, jelikož snížení hladiny eIF3c způsobuje kodon specifické snížení přesnosti rozpoznání start kodonu a zvýšení množství eIF5; eIF5 je společně s eIF1, 1A a 2 jedním z hlavních faktorů v ovlivňující tento proces. Objevila jsem, že eIF3 váže eIF5 špičkou svého...
|
|
|
Interplay between the tRNA anticodon stem and small ribosomal proteins forming the decoding site during stop codon readthrough
Čapková, Zuzana ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Eliáš, Marek (oponent) ; Macíčková Cahová, Hana (oponent)
Transferové RNA (tRNA) představují nepostradatelnou součást tvorby proteinů, které během elongace přivádějí aminokyseliny na A-místo ribozomu. Pravidla, kterými se řídí správná shoda mezi antikodonem tRNA a kodonem mRNA v A-místě, jsou stanovena genetickým kódem. Konkrétně kód definuje, že 61 kodonů je rozpoznáváno tRNA a 3 stop kodony označující ukončení translace jsou rozpoznávány uvolňovacím faktorem. Za určitých okolností však může být stop kodon rozeznán tzv. near-cognate (nebo cognate) tRNA a translace pokračuje dále. Tento proces, nazývaný pročítání stop kodonu, může být přínosný pro terapii dědičných genetických onemocnění způsobených předčasnými terminačními kodony (PTC) a také je klíčový pro organismy s přeřazováním identity stop kodonu na kodon kódující aminokyselinu. V této práci ukazuji, že kromě samotného antikodonu, antikodonové rameno dvou různých near-cognate tRNA, jmenovitě kvasinkové tRNAGln CUG a tRNATrp CCA Blastocrithidie nonstop, je rozhodující pro jejich potenciál pročíst stop kodony. Konkrétně demonstruji, že kvasinková tRNAGln CUG spoléhá na specifický pár bází pyrimidin 28 : purin 42, představující čtvrtý pár v jeho antikodonovém rameni (přesněji řečeno, ve stopce), zatímco tRNATrp CCA B. nonstop získala mutaci, která způsobila zkrácení jeho antikodonové stopky z...
|
|
|
Poruchy kmenových buněk v myším modelu Diamondovy-Blackfanovy anémie
Holečková, Markéta ; Kokavec, Juraj (vedoucí práce) ; Valášek, Leoš (oponent)
Diamondova-Blackfanova anémie (DBA) je vzácné vrozené onemocnění kostní dřeně, které je charakterizováno poruchami ve vývoji erytrocytů a bývá doprovázena širokou škálou jiných defektů. Je způsobena mutací v některém z genů ribozomálních proteinů, ve čtvrtině všech případů se jedná o gen RPS19. Mechanismus vzniku patologie této nemoci není dosud přesně znám. Pro lepší porozumění vztahu genotypu a fenotypu u DBA byl vytvořen myší model s homozygotní mutací vysoce konzervovaného argininu 67 (Rps19R67Δ/R67Δ ). Myší model s touto mutací vykazuje mnoho fenotypových příznaků odpovídajících těm, kterými trpí pacienti s DBA. V této diplomové práci se zaměřujeme na charakterizaci hematopoetických a erytropoetických vlastností tohoto myšího modelu. Prokázali jsme, že myši trpí anémií a k poruchám erytropoézy dochází ve stádiu proerytroblastů. V hematopoéze jsme pozorovali změny již od stádia multipotentních progenitorů. Role proteinu p53 v patogenezi DBA je již dlouho známá. Pracovali jsme proto i s modelem Rps19R67Δ/R67Δ Trp53-/- , na kterém jsme pozorovali záchranu fenotypu. Erytropoéza ani hematopoéza nebyla u tohoto myšího modelu narušena. Pomocí transkriptomické analýzy jsme prokázali, že u Rps19R67Δ/R67Δ myší dochází ke zvýšené expresi několika genů, které jsou všechny součástí p53 signální dráhy,...
|
|
| |
|
|
Characterization of RPG1, the large subunit of the yeast S. cerevisiae initiation translation factor 3 (eIF3)
Valášek, Leoš
Charakterizace RPG1, velké podjednotky kvasinek S. cerevisiae iniciačního translačního faktoru 3 (elF3). Disertační práce pro získání akademického titulu Doktor přírodních věd na Fakulta formálních a přírodních věd Vídeňské univerzity předložil Mag. Leoš Valášek Vídeň, září 1998 ABSTRAKT Eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3) se skládá z nejméně osmi podjednotek a hraje klíčovou roli při tvorbě preiniciačního komplexu 43S tím, že disociuje ribozomální podjednotky 40S a 60S, stabilizuje ternární komplex a podporuje vazbu mRNA na ribozomální podjednotky 40S. Bylo popsáno, že produkt genu RPG1 S. cerevisiae kóduje protein potřebný pro průchod fází G1 buněčného cyklu a vykazuje významnou sekvenční podobnost s největší podjednotkou lidského eIF3. Zde ukazuji, že za nedenaturačních podmínek Rpg1p ko-purifikuje se známou kvasinkovou podjednotkou eIF3, Prt1p. Protilátka proti Rpg1p ko-imunoprecipituje Prt1p a protilátka namířená proti Myc-značce označené verze Prt1p ko-imunoprecipituje Rpg1p, což dokazuje, že oba proteiny jsou přítomny ve stejném komplexu. Integrita tohoto komplexu není ovlivněna zvýšenou teplotou na pozadí teplotně citlivého mutantního kmene rpg1-1. Bezbuněčný translační systém odvozený z tohoto teplotně citlivého mutantního kmene rpg1-1 se inkubací při 37 řC inaktivuje a jeho aktivitu lze obnovit...
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
|
|
Molecular principles of translation reinitiation in mammals
Hronová, Vladislava ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Iniciace translace představuje mnohastupňový proces, který zajišťuje sestavení 80S ribosomu na AUG start kodonu molekuly mRNA, jež má být přeložena do polypeptidového řetězce. Správný průběh tohoto procesu je řízen mnoha eukaryotickými iniciačními faktory (eIFs), z nichž nejdůležitějším je eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3). Hlavním cílem naší laboratoře je co nejpodrobněji popsat proteinový komplex eIF3 a také způsoby, jakými tento faktor přispívá k jednotlivým krokům procesu iniciace translace. Kromě toho též zkoumáme jeden z genově specifických kontrolních mechanismů translace zvaný reiniciace, který je, alespoň u kvasinek, umožňován právě faktorem eIF3. V této práci popisuji, že N-terminální doména (NTD) jedné z největších podjednotek kvasinkového eIF3, označované jako a/Tif32, hraje důležitou úlohu nejen ve vazbě eIF3 k 40S ribozomální podjednotce, ale taktéž významně přispívá k nasedání mRNA na 43S preiniciační komplexy in vivo. Stabilizační role N-terminální domény podjednotky a/Tif32 byla ověřena též v naší následující studii, a to biofyzikálními experimenty. Pomocí dalších in vivo přístupů jsme v této práci též dokázali, že pro mRNA s delšími 5'nepřekládanými oblastmi je stabilizační role a/Tif32-NTD důležitější než pro mRNA s krátkými 5'nepřekládanými oblastmi. V následujících...
|
|
|
Functional analysis of the TIF32-HLD-PRT1-RRM-HCR1 module of the yeast translation initiation factor 3
Herrmannová, Anna ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent)
The eIF3 is in yeast S. cerevisiae composed of five core essential subunits (TIF32, NIP1, PRT1, TIF34 and TIF35) and one nonessential substoichiometric subunit (HCR1), and as such represents the most complex initiation factor among all. Perhaps owing to that, it was shown to stimulate nearly all steps of the initiation pathway culminating in the formation of the 80S initiation complex at the AUG start codon on mRNA. Yeast eIF3 was also demonstrated to assemble together with the ternary complex, eIF1 and eIF5 into so called Multifactor complex that can exist free of ribosomes and whose formation greatly stimulates initiation efficiency. TIF32, the largest eIF3 subunit, was shown to make at least two critical contacts with the 40S ribosomal subunit and its middle domain, designated as the HLD, to share a significant sequence similarity with the HCR1 subunit. Experiments conducted here indicate that the TIF32-HLD and HCR1 share also some functional similarity as the recombinant HLD expressed under control of the HCR1 promoter in a domain- swapping experiment partially suppressed the slow growth phenotype of cells deleted for HCR1. In addition to the HLD, HCR1 also simultaneously interacts with the RRM domain of PRT1, which is considered to be the main scaffolding subunit of eIF3. The group of Dr. P.J....
|
|
|
Translation reinitiation mechanism on mRNA of trascriptional activator GCN4.
Vlčková, Vladislava ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Strachotová, Dita (oponent)
Translační reiniciace je genově specifický mechanismus kontroly translace, který využívá schopnosti něktrých krátkých otevřených čtecích rámců (uORFs) předcházejících v mRNA hlavní otevřený čtecí rámec zadržet 40S ribosomální podjednotku na mRNA poté, co ribosom na tomto uORF translaci ukončil. Efektivita tohoto procesu je ovlivněna tím, jaké nukleotidové sekvence uORF obklopují a jak rychle je ribosomem překládán, zdali jsou přítomny vybrané iniciační faktory, a také vzdáleností tohoto uORF od hlavního otevřeného čtecího rámce. Přestože přesný mechanismus reiniciace není dosud zcela znám, v posledních letech byly některé jeho dílčí kroky objasněny za pomoci studia mechanismu translační kontroly genu GCN4. Ukázalo se například, že naprosto nezbytná pro tento proces je účast eIF3. eIF3 specificky interaguje s mRNA sekvencí předcházející uORF, a tím významně napomáhá zadržení 40S podjednotky na mRNA a následné reiniciaci. Cílem této práce je shrnutí současných poznatků týkajících se mechanismu reiniciace translace. Jako příklad byl zvolen kvasinkový transkripční aktivátor GCN4, translace jehož mRNA je přísně řízena právě mechanismem reiniciace.
|
host ::
RSS.