|
|
Klonování, exprese a purifikace mykobakteriální dihydrofolátreduktasy
Šedivá, Kateřina ; Novotná, Eva (vedoucí práce) ; Malátková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Řešitel: Kateřina Šedivá Školitel: Mgr. Eva Novotná, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace mykobakteriální dihydrofolátreduktasy Dihydrofolátreduktasa je enzym nezbytný pro metabolismus kyseliny listové - katalyzuje redukci dihydrofolátu na tetrahydrofolát. Tetrahydrofolát je důležitým kofaktorem při reakcích přenášejících jednouhlíkaté zbytky. Hraje klíčovou roli v syntéze DNA, RNA a proteinů. Dihydrofolátreduktasa se nachází také u M. tuberculosis. Tato bakterie je nejčastějším původcem tuberkulózy u lidí. Právě dihydrofolátreduktasa by mohla být potenciálním cílem pro vývoj nových antituberkulotik. Rekombinantní protein dihydrofolátreduktasa byl připraven v několika krocích. Sekvence kódující protein byla nejprve amplifikována polymerásovou řetězovou reakcí. Ligací namnoženého úseku DNA a plazmidu pET-28b(+) vznikl rekombinantní plazmid, který byl metodou tepelného šoku transformován do kompetentních buněk E. coli kmen HB101. K expresi proteinu byly použity buňky E. coli kmen BL21(DE3). Samotná exprese byla indukována přidáním isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Získaný rekombinantní protein byl izolován a purifikován metodou afinitní chromatografie. Metodou dle Bradfordové...
|
|
|
Studium stability katalytické domény neutrální trehalasy pomocí diferenční skenovací fluorimetrie
Šmídová, Aneta ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Kacířová, Miroslava (oponent)
Předkládaná bakalářská práce je součástí projektu, jehož záměrem je krystalizace trehalasové domény neutrální trehalasy Nth1 ze Saccharomyces cerevisiae. Hlavním cílem této bakalářské práce je optimalizace purifikačního protokolu dvou různých konstruktů kvasničné Nth1 a určení optimálního pufru pro krystalografii těchto konstruktů pomocí metody diferenční skenovací fluorimetrie DSF. Trehalasy jsou důležité, vysoce konzervované enzymy, které se nacházejí v řadě organismů. Tyto enzymy patří do třídy hydrolas, podskupiny glykosidas a jejich společnou vlastností je to, že hydrolyticky štěpí molekulu trehalosy na dvě jednotky glukosy. Trehalosa je přirozeně se vyskytující neredukující disacharid, který slouží v buňkách kvasinek jako zásobárna uhlíku a energie a dále jako universální ochrana proti stresovým podmínkám. Trehalosa a její hydrolýza je důležitá v životním cyklu hmyzu, neboť je přítomná jako hlavní cukerná složka hemolymfy hmyzu, takže některé trehalasové inhibitory by mohly být využity jako insekticidy. Do této doby však byla vyřešena pouze jediná struktura trehalasy z prokaryotního organismu Escherichia coli. Z tohoto důvodu je velmi důležité vyřešit strukturu trehalasy z eukaryotního organismu. Klíčová slova Nth1, exprese, purifikace, DSF Klíčové předměty Proteinová biochemie, biofyzikální...
|
|
|
Estetický faktor v pojetí zkušenosti Johna Deweyho: Estetická relevance snowbordingu
Vyhnánková, Klára ; Kaplický, Martin (vedoucí práce) ; Dadejík, Ondřej (oponent)
Diplomová práce objasňuje pojetí zkušenosti Johna Deweyho a zaměřuje se především na jeho tezi o přítomnosti estetického faktoru v každé ucelené, završené zkušenosti. Zabývá se rozdíly mezi běžnými a završenými zkušenostmi a zkoumá v nich působení estetického faktoru. Jeho nezastupitelná role je úmyslně demonstrována na mimouměleckém příkladu zážitků, které přináší snowboarding. Nejdůležitější poznatky jsou rozvinuty skrze přístup somaestetiky Richarda Shustermana. Teorie těchto dvou myslitelů podporují hlavní myšlenku práce, že dynamické pohyby těla mohou jejich aktérům přinášet estetické zážitky. Odhalí se tak některé na první pohled nezřetelné důvody atraktivity tohoto novodobého sportu.
|
|
|
Impact of Toll-like receptor 4 polymorphism on pro-inflammatory responsiveness in great tit (Parus major)
Vinklerová, Jitka ; Bryja, Josef (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Toll-like receptor 4 (TLR4) je jedním z nejdůležitějších Pattern recognition receptorů, jehož úkolem je včasné rozpoznání bakteriální infekce. Po navázání endotoxinu (lipopolysacharidu, LPS) na TLR4 dochází ke spuštění signální kaskády vedoucí k produkci imunomodulčaních molekul, cytokinů. Jednou z funkcí cytokinů je řídit infiltraci leukocytů z krevního řečiště do místa zánětu, která vede ke vzniku otoku. Patogen je následně eliminován těmito buňkami fagocytózou a oxidačním vzplanutím. Je známo, že polymorfismus v TLR4 může ovlivňovat resistenci hostitelského organismu k některým chorobám. TLR4 by tak mohl hrát důležitou roli v koevoluci hostitele a parazita. Ve své diplomové práci jsem se zaměřila na aminokyselinovou substituci Q549R v TLR4, která je u sýkory koňadry asociovaná s mírou exprese ornamentálního zbarvení. U jedinců, kterým bylo injikováno LPS, došlo k poklesu poměru heterofilů a lymfocytů (H/L) v krvi. Tento pokles mohla způsobit infiltrace krevních buněk do zanícené tkáně. Naopak u zvířat, kterým bylo injikováno pouze PBS, došlo k nárůstu H/L, patrně v důsledku stresu. Prokázala jsem, že substituce Q549R nemá vliv na celkovou kondici či hematologické parametry jedince. Zjistila jsem však vliv interakce mezi genotypem Q549R hostitele a typem LPS (Escherichia coli / Salmonella...
|
|
| |
|
|
Imunogenetické a hormonální predispoziční markery systémových revmatických onemocnění,zejména systémového lupus erythematodu
Fojtíková, Markéta ; Pavelka, Karel (vedoucí práce) ; Hrnčíř, Zbyněk (oponent) ; Rovenský, Jozef (oponent)
Fojtikova2011 ÚVOD: V multifaktoriální etiopatogenezi systémových revmatických chorob je nezbytná genetická vnímavost. PRL je účinný imunomodulátor, který podporuje rozvoj autoimunity. CÍLE PRÁCE: 1. Zjistit imunogenetický background, HLA II. a I. třídy a alely mikrosatelitového polymorfismu transmembránové části exonu 5 genu MIC-A (dále MIC-A), u SLE a PsA. 2. Zjistit, zda PRL v séru a synoviální tekutině ovlivňuje klinický a laboratorní průběh RA. 3. Zjistit, zda se funkční polymorfismus -1149 G/T SNP mimohypofyzárního promotoru PRL genu podílí na rozvoji a fenotypu SLE, RA, PsA, SSc a zánětlivých myopatií. METODIKA: Genetické analýzy u souborů nemocných se SLE (n=156), RA (n=173), PsA (n=100), SSc (n=75), PM (n=47) a DM (n=68) a 123 zdravých jedinců: PCR-SSP (HLA I. a II. třídy), PCR-fragmentační analýza (MIC-A) a PCR-RFLP (-1149 G/T SNP PRL). Detekce PRL v séru a synoviální tekutině u 29 RA a 26 OA pomocí radioimunometrické analýzy. VÝSLEDKY: 1. Rizikové imunogenetické markery SLE v české populaci jsou alela HLA-DRB1*03 (pc = 0.008; OR 2.5) a haplotyp HLA-DRB1 *03-DQB1*0201 (pc <0.001;OR 4.54). Frekvence MIC-A5.1 je vyšší u SLE než u zdravých (pc =0.005; OR 1.88). MIC-A5.1 spolu s HLA-DRB1*03 výrazně zvyšuje riziko SLE, pc <0.000001; OR 9.71. Alela HLA-Cw*0602 je častější u PsA s psoriázu I....
|
|
|
Pohybové vyjádření básní v předškolním věku dítěte
Hujerová, Václava ; Hník, Ondřej (vedoucí práce) ; Klumparová, Štěpánka (oponent)
Diplomová práce se zabývá problematikou propojení poezie a pohybu v mateřské škole. Má za cíl ověřit, jestli děti získají k poezii hlubší vztah, když jim ji zprostředkuji v propojení s pohybem, než když je s poezií budu seznamovat pouze slovně. Předpokládám, že propojení poezie s pohybem bude děti více bavit díky jejich vrozené potřebě pohybu a synkretickému vnímání. V teoretické části se zabývám znaky poezie, vztahem dětí k poezii a jejím významem pro rozvoj osobnosti dětí. Vzhledem k tomu, že jde o pohybové ztvárnění básní, nezapomínám ani na kapitoly týkající se pohybové výchovy a jejího významu pro rozvoj osobnosti dětí. Výzkum uskutečňuji v mateřské škole v Praze 1 s dvaceti pětiletými dětmi. Metodou výzkumu je experiment a pozorování. Výzkum je rozdělen do deseti dnů. Každý den seznámím děti s jednou básní nejprve odděleně od pohybu, poté v integraci s pohybem. Zapisuji si body signalizující míru zájmu jednotlivých dětí. Zjistila jsem, že při propojení básní s pohybem zájem všech dětí o 17% vzrostl. Z toho usuzuji, že když budu poezii s pohybem propojovat, bude děti poezie více bavit a získají tak k ní hlubší citový vztah. Navíc se prostřednictvím integrace vzdělávacích oblastí harmonicky rozvíjí osobnost dětí, což je podle mého názoru ten nejlepší předpoklad pro úspěšný životní start.
|
|
|
Analýza životního cyklu BK viru
Bakardjieva - Mihaylova, Violeta ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Mindlová, Martina (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry, jejichž replikace probíhá v buněčném jádře. I přes svoji malou genomovou velikost mohou tyto viry způsobit výrazné změny v hostitelské buňce, jednou z nejvýznamnějších je nádorová transformace. Většina studií lidských patogenů z této čeledi je středem zájmu klinických výzkumů, které však neposkytují dostatek informací o jednotlivých událostech životního cyklu virů. Tato práce se hlavně zabývá přesným určením doby kdy dochází ke vzniku jednotlivých virových produktů a vytvořením časového sledu událostí během infekce v přirozených buňkách, které jsou cílem pro BKV v lidském organizmu. Bylo zjištěno, že časový průběh životní cyklus BKV se velice podobá těm pro modelové polyomaviry MPyV a SV40 a v permisivních buňkách trvá přibližně 40 - 50 hodin.
|
|
| |
|
|
Příprava vazebných partnerů 14-3-3 proteinů pro strukturní studie.
Kopecká, Miroslava ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Tyrosinhydroxylasa patří do skupiny hydroxylas aromatických aminokyselin a katalyzuje počáteční krok biosyntézy katecholaminových neuropřenašečů. Tento enzym má homoteramerní strukturu a skládá se ze tří strukturních domén: N-koncové regulační domény, katalytické domény a C-koncové tetramerizační domény. Aktivita tyrosinhydroxylasy je regulována fosforylací a regulací na úrovni exprese. Fosforylace Ser-19 umožňuje navázání proteinu 14-3-3, které ovlivňuje strukturu regulační domény a chrání ji před její defosforylací a degradací. Struktura regulační domény je stále neznámá, proto jsme se rozhodli pro její objasnění pomocí technik nukleární magnetické rezonance. Byl optimalizován expresní a purifikační protokol regulační domény tyrosinhydroxylasy. Protein byl exprimován jako fúzní protein obsahující histidinovou kotvu na N-konci polypetidového řetězce. Purifikace se skládala ze dvou kroků: z niklové chelatační chromatografie a gelové permeační chromatografie. Dynamický rozptyl světla a 1 H-NMR spektroskopie byly využity k ověření monodisperzity proteinu a jeho možného použití pro další experimenty.
|
host ::
RSS.