|
|
Kooperativita složek systému cytochromů P450 a ovlivnění metabolismu léčiv a karcinogenů
Holý, Petr ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Systém oxidas se smíšenou funkcí (MFO systém) hraje důležitou roli v metabolismu mnoha endogenních látek a xenobiotik (např. karcinogenů, léčiv). Membránové hemoproteiny nazývané cytochromy P450 jsou zásadní složkou tohoto systému. Reakce katalyzované cytochromy P450 jsou ovlivňovány působením jiného proteinu MFO systému, a to cytochromem b5 (cyt b5). Mechanismus, jakým cyt b5 působí, ještě nebyl zcela objasněn. Jednou z možností studia této protein-proteinové interakce je metoda kovalentního síťování. Záměnou methioninu ve struktuře cyt b5 za jeho foto-aktivovatelný analog (foto-methionin) je možné připravit analog cyt b5 (foto-cyt b5), který po aktivaci UV zářením kovalentně váže cytochrom P450 v membránovém prostředí. Tato práce se zabývá expresí a izolací rekombinantního analogu cyt b5 s pouze jednou pozicí pro methionin (96) v primární struktuře proteinu a jeho substitucí za foto-methionin. Protein byl purifikován s výtěžkem 6 mg na 1 l bakteriální suspenze. Analýza hmotnostní spektrometrií (MALDI-TOF/TOF) ukázala, že methionin byl v sekvenci substituován foto-reaktivním analogem z asi 30 % (pokrytí sekvence 77 %). Foto- cyt b5 byl použit k fixování transientní protein-proteinové interakce s cytochromem P450 2B4 (CYP2B4). Foto-cyt b5 byl rekonstituován v lipidovém systému s CYP2B4 a...
|
|
|
Teoretická studie enzymů spojených s procesem karcinogeneze: DNA polymerázy β a cytochromů P450
Jeřábek, Petr ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Ettrich, Rüdiger (oponent)
Disertační práce přispěla k poznání funkce dvou typů enzymů participujících na procesech karcinogeneze, DNA polymerázy (pol ) a cytochromů P450 (CYP). Pol je součástí opravného systému DNA "Base Excision Repair" (BER), kde tento enzym provádí vkládání nového nukleotidu do řetězce DNA na základě párování s bází templátového řetězce. Mutované formy pol byly nalezeny v 30% lidských tumorů, což ukazuje na její důležitou úlohu v procesu karcinogeneze. V disertační práci byly studována schopnost pol rozlišovat mezi "správnou" a "špatnou" bází v průběhu jejího vkládání do DNA, tzv. "fidelitu" (přesnost přiřazení "správného" nukleotidu, v duchu pravidel komplementarity). K tomu byly využity metody počítačového modelování, vhodné pro porovnání energetických rozdílů mezi komplexy obsahující "správnou" a "špatnou" bází. Použita byla metoda výpočtu volných energií LRA. Výsledky signalizují, že jeden z hlavních příspěvků k celkové "fidelitě" pol spočívá v lepší stabilizaci tranzitního stavu nukleofilní substituce "správné" báze, oproti "špatné". Tento rozdíl přispívá 80-ti násobkem k celkové "fidelitě"¨ tohoto enzymu. Identifikovány byly i strukturní prvky, které jsou důležité pro "fidelitu" pol i katalýzu tohoto enzymu. Pro studium sledující vliv mutací na "fidelitu" pol byly použity metody FEP...
|
|
|
Oxidace ellipticinu lidskými cytochromy P450 exprimovanými v prokaryotním a eukaryotním systému
Vejvodová, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Ellipticin, protinádorový alkaloid, představuje léčivo, jehož mechanismus účinku je založen na interkalaci do DNA, inhibici topoisomerasy II a na tvorbě kovalentních aduktů s DNA prostřednictvím enzymové aktivace cytochromy P450 a/nebo peroxidasami. Ellipticin je oxidován cytochromy P450 až na pět metabolitů (7-hydroxy-, 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu). Z těchto metabolitů jsou 9-hydroxy- a 7- hydroxyellipticin považovány za detoxikační metabolity, zatímco 12-hydroxyellipticin, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu za aktivační metabolity, které jsou zodpovědné za tvorbu kovalentních aduktů s DNA. V diplomové práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotním (SupersomesTM ) a dvou prokaryotních expresních systémech (Bactosomes) v oxidaci ellipticinu. Cytochromy P450 exprimované v prokaryotních systémech se lišily v množství "koexprimované" NADPH:CYP reduktasy. Vzniklé metabolity ellipticinu byly analyzovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské cytochromy P450 CYP2C9/2D6/2C19 exprimované v prokaryotním nebo eukaryotním systému oxidují ellipticin za vzniku až čtyř metabolitů: 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13-hydroxyellipticinu and N2 -oxid ellipticinu. Jejich účinnost se ale...
|
|
|
Oxidace benzo(a)pyrenu cytochromem P450 1A1 exprimovaným v prokaryotickém a eukaryotickém systému
Kroftová, Natálie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Benzo[a]pyren (BaP) je významným lidským kancerogenem. Je metabolizován řadou enzymových systémů jako jsou cytochromy P450 (CYP) a epoxidhydrolasa. Cílem předkládané diplomové práce bylo studium metabolismu BaP in vitro jaterním mikrosomálním systémem potkanů premedikovaných induktory cytochromů P450 a dále lidským cytochromem P450 1A1 (CYP1A1) exprimovaným v eukaryotickém a prokaryotickém systému. Eukaryotický expresní systém byl tvořen mikrosomy izolovanými z hmyzích buněk, zatímco prokaryotický expresní systém tvořily "zlomky" membrán E. coli. V rámci rekombinantního lidského CYP1A1 byl zkoumán vliv cytochromu b5, NADPH:cytochrom P450 reduktasy (CPR) a epoxidhydrolasy na oxidaci BaP. Izolace a purifikace králičí jaterní CPR byla dalším cílem této práce. Metabolity vzniklé oxidací BaP byly separovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že jaterní mikrosomální systémy potkanů premedikovaných induktory CYP podrodiny 1A (Sudanem I), podrodiny 2B (fenobarbitalem) a podrodiny 3A (PCN) vykazují vyšší efektivitu oxidovat BaP než mikrosomy kontrolních potkanů. BaP je oxidován lidským CYP1A1 exprimovaným v eukaryotickém systému na šest metabolitů (BaP-9,10-dihydrodiol, metabolit BaP s dosud neurčenou strukturou, BaP-7,8-dihydrodiol, BaP-1,6-dion, BaP-3,6-dion a BaP-3-ol), zatímco...
|
|
|
Vliv analogů hemu na strukturu a konformační stabilitu cytochromu b5
Maroušková, Růžena ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
Cytochrom b5 je součástí systému oxidas se smíšenou funkcí (MFO systému), který se podílí na metabolismu řady endogenních i exogenních látek. Jeho funkce je úzce spjata s dalším významným enzymem tohoto systému - cytochromem P450. Cílem této bakalářské práce bylo prozkoumat, jak analogy hemu ovlivňují strukturu a konformační stabilitu cytochromu b5. Ke studiu byla použita v laboratoři dosud nezavedená metoda - pulzní proteolýza, která využívá štěpení proteinu v různých koncentracích močoviny. Protein byl štěpen nespecifickou proteasou thermolysinem, která je aktivní i v prostředí s vysokou koncentrací močoviny. Pro studium stability cyt b5 byly připraveny holoformy cytochromu b5 obsahující hem a jeho analogy, kde jsou místo železitých iontů vázány ionty Mn3+ , Cr3+ či Co3+ . Analogy cytochromu b5 byly připraveny pomocí titrace apoformy cytochromu b5 heminem a jeho analogy. Pulzní proteolýza byla provedena i s apoformou cytochromu b5 a výsledky byly vyhodnoceny za použití elektroforézy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného. Klíčová slova: elektroforéza, proteolýza, cytochrom b5, stabilita.
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
|
|
Studium složení a organizace enzymového systému cytochromu P450 technikou kovalentního síťování
Koberová, Monika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Hansíková, Hana (oponent)
Systém oxygenas se smíšenou funkcí (MFO systém) se významnou rolí podílí na metabolismu endogenních sloučenin i xenobiotik. Tento systém obsahuje cytochrom P450, NADPH:cytochrom P450 reduktasu a také jsou k němu přiřazovány NADH:cytochrom b5 reduktasa a cytochrom b5. Bylo prokázáno, že cytochrom b5 může stimulovat nebo inhibovat reakce katalyzované cytochromy P450, a dokonce může měnit poměr vzniklých metabolitů. Mechanismus působení cytochromu b5 nebyl dosud zcela objasněn. Zjištění protein-proteinových interakcí v MFO systému a určení topologie tohoto systému by mohlo pomoci k objasnění mechanismu působení cytochromu b5. Vhodnou metodou pro identifikaci protein-proteinových interakcí uvnitř membrány je technika kovalentního síťování. Cytochrom b5 obsahuje 3 methioniny, z čehož jsou 2 lokalizovány v C-terminální membránové kotvě. Po záměně těchto dvou methioninů za fotoaktivovatelný analog methioninu (foto-methionin) a následné fotoaktivaci lze určit interakce s cytochromem P450 v membránovém prostředí. Tato práce se zabývá expresí a izolací foto-cytochromu b5 (foto-cyt b5), analogu cytochromu b5 s inkorporovaným foto-methioninem. Podmínky pro inkorporaci foto- methioninu do cytochromu b5 byly optimalizovány a protein byl purifikován s výtěžkem 7,2 mg z 1 l bakteriální suspenze. Izolovaný foto-cyt...
|
|
|
Mechanismus působení protinádorového léčiva ellipticinu v cílových tkáních jeho účinku
Vranová, Iveta ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Ellipticin je alkaloid čeledě Apocynaceae, který vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Na metabolismu ellipticinu se podílí cytochromy P450 (CYP) a peroxidasy za vzniku aktivačních a detoxifikačních metabolitů. Již v dřívějších pracích byly identifikovány jednotlivé isoformy CYP, které se podílí na oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce, ledviny) laboratorního potkana, vhodného modelu ilustrujícího osud ellipticinu v lidském organismu. V této diplomové práce byl studován vliv ellipticinu na obsah a aktivitu cytochromů P450 a na dalších složek MFO systému v tomto zvířecím modelu. Pro stanovení obsahu CYP a dalších složek MFO systému v isolovaných mikrosomech byly využity spektroskopické a elektrochemické metody. Pro stanovení katalytické aktivity CYP a NADPH:cytochrom P450 reduktasy byly využity reakce se specifickými substráty. Z výsledků vyplývá, že u zvířat premedikovaných ellipticinem dochází k zvýšení exprese i katalytické aktivity CYP podrodiny 1A ve všech testovaných orgánech (játra, ledviny, plíce). V játrech navíc dochází vlivem ellipticinu ke zvýšení exprese cytochromu b5 a zvýšení exprese a katalytické aktivity CYP3A. Podobně se i obsah a katalytická aktivita NADPH:cytochrom P450 reduktasy měnila v závislosti na premedikaci zvířat ellipticinem. Cytochrom P450 2S1...
|
|
|
Studium inkorporace modifikovaných aminokyselin do cytochromu b5
Koberová, Monika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Pavlásková, Kateřina (oponent)
Cytochrom b5 (cyt b5) může ovlivňovat reakce katalyzované cytochromy P450, a v důsledku toho se může podílet i na aktivaci látek (například léčiv, karcinogenů) případně ovlivňovat poměry vzniklých metabolitů. Mechanismu působení cyt b5 ještě nebyl zcela objasněn. Přínosem k objasnění mechanismu by mohlo být zjištění protein-proteinových interakcí v monooxygenasovém systému, kterého je tento protein součástí. Pro studium těchto interakcí pomocí síťovacích technik je vhodné připravit fotolabilní cyt b5, který by se po fotoaktivaci stal vysoce reaktivním a vytvořil by komplex s nejbližšími složkami v monooxygenasovém systému.Tato práce se zabývá vypracováním metody pro produkci rekombinantního cyt b5 s modifikovanými aminokyselinami. Cyt b5 byl exprimován v bakteriálním kmeni E.coli BL-21 (DE3) Gold. Před indukcí exprese byly bakterie převedeny do limitního media (DMEM-LM), které neobsahovalo L-leucin a L-methionin. Limitní mediu bylo doplněno modelovou deuterovanou aminokyselinou d3-methyl-L-methioninem a D,L-leucinem. Exprimovaný cyt b5 byl izolován a inkorporace d3-methyl-methioninu byla ověřena hmotnostní spektrometrií. V úvodních experimentech byl cyt b5 získán převážně jako apoprotein (apo-cyt b5). Pro zvýšení inkorporace hemu do apo-cyt b5 byl studován vliv teploty na inkorporaci hemu při...
|
|
|
Aktivita cytochromů P450 1A1, 1A2 a 3A4 exprimovaných v eukaryotních a prokaryotních systémech
Indra, Radek ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Mizerovská, Jana (oponent)
Cytochromy P450 (CYP) tvoří superrodinu hemových proteinů, jenž je široce rozšířená v přírodě. Jsou důležité pro metabolismus širokého spektra substrátů a katalyzují řadu chemických reakcí. Hrají centrální roli v metabolismu chemoterapeutik (léčiv). Mají také schopnost aktivovat některé protinádorové činidla. Ellipticin, alkaloid nalezený v rostlinách čeledi Apocynaceae, je příkladem takového substrátu cytochromů P450. V práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotickém a prokaryotickém expresním systému, jmenovitě v SupersomechTM , což jsou mikrosomy izolované z hmyzích buněk transfekovaných baculovirem nesoucím cDNA lidských CYP1A1, 1A2 a 3A4 s NADPH:cytochrom P450 reduktasou nebo v Bactosomech, které jsou membránovou frakcí buněk E. coli transfekovaných cDNA stejných lidských cytochromů a NADPH:cytochrome P450 reduktasou, pro oxidaci jejich markerových substrátů a ellipticinu. Cytochrom b5, fakultativní složka systému oxidas se smíšenou funkcí, která metabolizuje xenobiotika, byl také exprimován v některých systémech. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské CYP1A1, 1A2 nebo 3A4 exprimované v prokaryotickém nebo eukaryotickém systému oxidují své markerové substráty (EROD pro CYP1A1/2, MROD pro CYP1A2 a 6β-hydroxylaci testosteronu pro...
|
host ::
RSS.