|
| |
|
|
Vztah struktury a funkce a využití RTX proteinů gramnegativních bakterií
Sadílková, Lenka ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Stulík, Jiří (oponent) ; Weiser, Jaroslav (oponent)
Označení RTX (Repeat in ToXin) spojuje početnou a stále se rozrůstající skupinu proteinů rozličných funkcí. Pro všechny její členy, mezi něž se řadí například toxiny, metaloproteasy, lipasy, proteiny S-vrstvy, bakteriociny a proteiny s dosud neobjasněnou funkcí, jsou typické následující charakteristiky: i) přítomnost nonapeptidové a na glycin bohaté vápník-vazebné konsensus sekvence GGXGXDX[L/I/V/W/Y/F]X (kde X může být jakýkoliv aminokyselinový zbytek) v různém počtu opakování (6-50) v C-koncové části proteinu; ii) k sekreci proteinu z buňky dochází bez přítomnosti periplasmatického intermediátu mechanismem zahrnujícím rozpoznání C-koncového sekrečního signálu proteiny asociovanými s cytoplasmatickou membránou, které následně exportují protein do kanálu procházejícího skrze celou bakteriální buněčnou stěnu ven z buňky (sekreční systém typu I); iii) geny pro syntézu strukturního proteinu, jeho aktivaci a sekreci jsou většinou uskupeny v tzv. RTX operonu. Nejrozsáhlejší skupinu rodiny RTX proteinů tvoří RTX toxiny. Většinou se jedná o proteiny o molekulové hmotnosti mezi 100-200 kDa, posttranslačně modifikované acylací mastnou kyselinou. Acylace je zprostředkována specifickým aktivačním proteinem. Tato posttranslační modifikace je naprosto nezbytná pro aktivaci molekuly toxinu a jeho funkci a...
|
|
|
Povrchový růst a diferenciace streptomycet na inertních mikrokuličkách - morfologická a proteomová analýza
Tesařová, Eva ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Streptomycety jsou vláknité, Gram-pozitivní bakterie, které jsou producenty více než 70 % všech prakticky využívaných antibiotik. Jsou zajímavé svým poměrně komplikovaným životním cyklem (morfologická diferenciace), který ústí ve vznik dormantních spor odolných vůči nepříznivým podmínkám a umožňujícím dlouhodobé přežití organizmu. Jejich přirozeným prostředím je hlavně půda. V laboratorních podmínkách jsou pěstované na pevném agaru a v tekutém médiu. V naší laboratoři byl vyvinut nový dvoufázový kultivační systém, který umožňuje reprodukovatelnou a kvantitativní přípravu vzorků pro proteomickou, transkriptomickou a metabolomickou analýzu diferenciace streptomycet. Tento systém je tvořen inertními mikrokuličkami a kapalným médiem. V naší studii byly použity dva druhy mikrokuliček - skleněné a zirkoniové. Sledovali jsme povrchový růst a diferenciaci streptomycet na těchto dvou druzích mikrokuliček optickou a elektronovou mikroskopií (SEM). Zjistili jsme podstatně větší nárůst streptomycet a vyšší produkci antibiotik na skleněných mikrokuličkách. Dalším rozdílem byl i tvar a velikost kolonií. V další části jsme se snažili pomocí srovnávací proteomiky identifikovat proteiny, které se podílejí na rozpoznání a přichycení vegetativních hyf na rozdílné povrchy. Ve třech experimentech a prostřednictvím...
|
|
|
Tvorba biofilmu Mycobacterium smegmatis na skleněných a zirkoniových kuličkách-proteomová studie
Sitařová, Barbora ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Tvorba biofilmů Mycobacterium smegmatis na skleněných a zirkoniových mikrokuličkách - proteomová studie Tvorba biofilmů je univerzální strategie bakterií pro přežití, tvorbou biofilmu bakterie získávají řadu výhod oproti planktonním buňkám. Přibližně 99% světové bakteriální populace se nachází ve formě biofilmů. Existence mikrobiálních biofilmů má pro lidstvo pozitivní i negativní dopad. Biofilmy předurčují úspěšnost patogena zvýšenou rezistencí vůči antibiotikům a imunitní reakci hostitelského organismu. Mykobakterie, které mají schopnost vytvářet biofilmy na různých povších se liší od ostatních bakterií unikátní stavbou buněčné stěny. Ta poskytuje bakterii vysokou odolnost vůči fyzikálnímu a chemickému poškození. To je jeden z důvodů proč je Mycobacterium tuberculosis považováno za velmi potentního patogena. Studium mykobakteriálních biofilmů je motivováno snahou zdokonalit a nalézt nové léčebné postupy. Tato práce je zaměřena na morfologickou a proteomickou srovnávací analýzu biofilmů získaných kultivací Mycobacterium smegmatis na povrchu skleněných a silica- zirkoniových mikrokuliček, biofilmu na povrchu média a planktonicky žijící kultury. Pro analýzu plovoucího biofilmu jsme vytvořili techniku přípravy preparátu umožňující pozorování v SEM. Ukázali jsme, že plovoucí biofilm vzniká ze shluků...
|
|
|
Využití gelově-založených proteomových technik při analýze genové exprese u prokaryotních a eukaryotních modelů
Petráčková, Denisa ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent) ; Stulík, Jiří (oponent)
Tato dizertační práce ukázala možnosti využití gelově-separační techniky 2-DE při řešení tří nezávislých vědeckých projektů. Proteomické studie vhodně doplnily výsledky získané i jinými přístupy a přispěly k celkovému zobrazení proteinové situace v daných biologických systémech. Srovnáváním celkového proteomu E. coli bylo identifikováno 61 proteinových změn v souvislosti s vývojem bakteriální populace v přítomnosti antibiotika erytromycinu. Tento "klasický" experiment zahrnoval vhodnou izolaci vzorku, separaci a analýzu bílkovin pomocí 2-DE s následnou identifikací proteinů pomocí MS. Nevýhodou bylo velké množství výsledných dat, které bylo potřeba zpracovat (počítačovou analýzou dat). Naproti tomu v případě studia membránového proteomu B. subtilis při pH stresu bylo třeba primárně modifikovat metodu izolace membránových a s membránou asociovaných bílkovin pro jejich vhodnou separaci na 2-DE Optimalizace zahrnovala především úpravy v použitých chemikáliích-detergentech podílejících se na solubilizaci proteinů a časové prodloužení tohoto procesu. Detegováno bylo následně 5 významných proteinových změn v odpovědi na pH stres týkajících se proteinů AcoB, SodA, YjcH, YwaC a YkwC. Data byla doplněna údaji o rigidizaci membrány B. subtilis v kyselém prostředí (stanoveno pomocí pulzní časově rozlišená...
|
|
|
Sledování tvorby plovoucího biofilmu Mycobacterium smegmatis - morfologická a proteomová analýza
Sochorová, Zuzana ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Mikroorganismy se mohou vyskytovat v planktonní formě nebo mohou ulpívat na povrchu a vytvářet trojrozměrné útvary zvané biofilmy. Plovoucí biofilmy, tvořené na rozhraní prostředí voda-vzduch, jsou jednou z životních strategií, kterou se mohou bakterie ubírat. Při studiu tohoto typu biofilmu nám jako laboratorní model sloužil nepatogenní druh Mycobacterium smegmatis. Pochopení mechanismů tohoto druhu by mohlo být aplikovatelné i na patogenní zástupce rodu Mycobacterium, jejichž studium obnáší v laboratorních podmínkách řadu nevýhod. Tato diplomová práce se zabývá morfologickou a proteomovou analýzou plovoucího biofilmu M. smegmatis. S využitím binokulární lupy a skenovací elektronové mikroskopie bylo pozorováno, že se bakterie na počátku tvorby biofilmu shlukují a vytváří tzv. "nukleační centra", ze kterých dochází k postupnému rozrůstání biofilmu do okolí. V pozdějších fázích vývoje dochází k jejich postupnému splynutí a vytvoření jednolité vrstvy, která s dalším vývojem sílí a utváří se vícevrstevnatý biofilm. Stěžejní metodou této práce byla dvourozměrná elektroforéza proteinů. S její pomocí byla provedena proteomová analýza plovoucího biofilmu. Před samotným provedením 2D elektroforézy bylo nutné optimalizovat přípravu proteinových vzorků a měření jejich koncentrace. Stejně jako u morfologické...
|
|
|
Růst Mycobacterium smegmatis na agarovém médiu a agarovém médiu pokrytém celofánovou folií - morfologická a proteomová studie
Ramaniuk, Volha ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
Tvorba biofilmů je jednou z nejčastěji používaných strategií umožňujících bakteriím přežít nepříznivé podmínky. Většina bakterií, včetně patogenů jako je například Mycobacterium tuberculosis, je schopna tvořit tyto trojrozměrné struktury. Zástupci rodu Mycobacterium se hojně vyskytují v přírodě, ale mohou způsobit i vážné problémy v případě výskytu ve zdravotnických zařízeních a na umělých náhradách v lidském těle. V našich experimentech jsme použili jako modelový organismus nepatogenní kmen Mycobacterium smegmatis mc2 155. Pomocí binokulární lupy a rastrovací elektronové mikroskopie jsme zkoumali morfologii tří- a šestidenních kolonií (v podstatě biofilmů) na agarových plotnách a agarových plotnách pokrytých celofánem. Zjistili jsme, že typ povrchu, stejně jako zdroj uhlíku, mají velký vliv na morfologii kolonií M. smegmatis. Následně jsme izolovali proteomy z kultur rostoucích na povrchu agaru a celofánu, a z planktonicky rostoucí kultury. Dvojrozměrná elektroforéza byla použita jako hlavní proteomická metoda. Proteinové profily, získané pomocí elektroforetických gelů, byly analyzovány pomocí softwaru PDQuest. Výsledky kvalitativních a kvantitativních analýz jsme porovnali pomocí Vennových diagramů. Identifikovali jsme 7 unikátních bílkovin, které by mohly být specifické pro adhezi M. smegmatis...
|
|
|
Analýza expresse intracelulárního patogena Francisella tularensis kultivovaného za stresových podmínek a v průběhu interakce s hostitelskou buňkou
Lenčo, Juraj ; Stulík, Jiří (vedoucí práce) ; Rychlík, Ivan (oponent) ; Weiser, Jaroslav (oponent)
Studium patogeneze bakteriálních infekcí v současné době patří mezi oblasti biomedicínského výzkumu, kterým je věnována značná pozornost. Tento stav je zapříčiněn zejména stále se rozšiřující rezistencí na antibiotika a antimikrobiální chemoterapeutika, v druhé řadě se tak děje v důsledku reálné hrozby zneužití vysoce patogenních bakteriálních kmenů jako teroristických prostředků. Urychlení výzkumu patogeneze infekčních onemocnění spolu s vývojem účinnějších vakcín a pokrokem v oblasti rychlých detekčních a typizačních technologií jsou logickou odpovědí států západního světa na události z 11. září 2001. Poznatky o molekulární patogenezi infekčních chorob mohou vést k objevu nových farmakologických cílů nebo ke konstrukci účinnějších a bezpečnějších vakcín pro aktivní či pasivní imunizaci. Významným zdrojem informací o molekulární patogenezi bakteriálních infekcí je mimo jiné studium reakcí mikroba na prostředí, se kterým se setkává v průběhu interakce s hostitelským organizmem. Evoluce této interakce se z pohledu hostitelských organizmů nesla ve znamení neustálého zdokonalování strategií, jak se účinně bránit vzniku bakteriální infekce, nebo strategií, které vedou k eliminaci infekce. Na straně mikroorganizmů mezitím docházelo ke zdokonalování nástrojů, jak zmiňované mechanizmy přežít či obejít....
|
|
|
Secondary metabolism and its regulation in Streptomyces ambofaciens: the study of cryptic secondary metabolite biosynthetic gene clusters
Nezbedová, Šárka ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Petříček, Miroslav (oponent) ; Mazodier, Philippe (oponent)
I. ABSTRACT in Czech Předložená práce se zabýva sekundárním metabolismem a jeho regulací u bakterií Streptomyces ambofaciens a Streptomyces lividans se zaměřením na nové biosyntetické dráhy. Během sekvenace chromozomů bakterií a nižších hub se ukázalo, že počet clusterů pro biosyntézu sekundárních metabolitů v genomu těchto bakterií je mnohem větší než bylo známo sekundárních metabolitů produkovaných těmito mikroorganizmy. Genové shluky jejichž produkty nebyly známy se začaly nazývat kryptické. Další výzkumy ukázaly, že alespoň některé z těchto kryptických genových shluků jsou za určitých podmínek exprimovány a kódují biosyntézu průmyslově využitelných sekundárních metabolitů (Gottelt et al., 2010; Gross et al., 2007; Pang et al., 2004). Kryptické klustery jsou proto považovány za jeden z možných "rezervoárů" nových bioaktivních látek. Inspirována těmito výsledky jsem se v předložené práci zabývala studiem kryptických biosyntetických klusterů sekundárních metabolitů u bakterie S. ambofaciens, jež je průmyslově využívána jako producent antibiotika spiramycinu. V druhé části práce jsem studovala regulaci produkce sekundárních metabolitů a zejména možnost delece či nadpordukce globálních regulátorů, která by vedla k aktivaci genů z kryptických biosyntetických klusterů. Třečí část práce se týká studia vlivu...
|
|
| |
host ::
RSS.