|
|
Role lipidových raftů při průniku adenylátcyklázového toxinu Bordetella pertussis cytoplasmatickou membránou
Chvojková, Věra ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Gahura, Ondřej (oponent)
Bordetella pertussis způsobuje u lidí infekční onemocnění černý kašel. Tato gramnegativní bakterie produkuje adenylátcyklázový toxin (CyaA), což je člen rodiny RTX proteinů. Toxin váže CD11b/CD18 integrinový receptor myeloidních fagocytů a dopravuje do jejich cytosolu enzym adenylátcyklázu, která po aktivaci kalmodulinem katalyzuje přeměnu ATP na důležitou signální molekulu cAMP. Tím dojde k rychlému nárůstu cAMP uvnitř buňky vedoucímu k narušení mikrobicidní schopnosti fagocytů. Nejnovější výsledky ukazují, že translokace katalytické adenylátcyklázové domény napříč buněčnou membránou probíhá ve dvou krocích. Po úvodní vazbě CyaA na toxinový receptor nastane nejprve toxinem zprostředkovaný vtok vápenatých iontů do buňky, což indukuje přesun toxin-receptorového komplexu do lipidového raftu, kde dojde k translokaci adenylátcyklázové domény přes cytoplasmatickou membránu. Objevením tohoto dvoukrokového mechanismu bylo vytvořeno nové paradigma pro membránovou translokaci toxinů z rodiny RTX.
|
|
|
Regulační úlohy proteinů PAG a CSK v FcɛRI signalizaci žírných buněk
Potůčková, Lucie ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent) ; Holáň, Vladimír (oponent)
9 2 ABSTRAKT (CZ) Tato disertační práce je zaměřena především na pochopení regulační úlohy C- terminální Src kinázy (CSK) a proteinu asociovaného s mikrodoménami bohatými na glykosfingolipidy (PAG) v FcɛRI zprostředkované signalizaci myších žírných buněk. FcɛRI aktivace je zahájena agregací receptoru komplexem multivalentního antigenu s IgE a následnou aktivací protein tyrozin kináz, protein tyrozin fosfatáz a dalších molekul signální transdukce. Signalizační děje vedou k degranulaci žírných buněk a uvolnění prozánětlivých mediátorů zodpovědných za vznik alergických onemocnění. Poznání funkce klíčových regulačních molekul, které kontrolují FcɛRI zprostředkovanou aktivaci, degranulaci a cytokinovou produkci žírných buněk, může mít terapeutický dopad. CSK je hlavním negativním regulátorem protein tyrozin kináz z rodiny Src (SFK), které hrají kritickou úlohu v různých imunoreceptorových dějích. Funkce CSK v žírných buňkách však není zcela objasněna. Předpokládá se, že CSK lokalizovaná v cytoplazmě je translokována do blízkosti membránově vázaných SFK s využitím membránových adaptorových proteinů a PAG byl hlavním kandidátem. Pro určení úlohy proteinů CSK a PAG v FcɛRI signalizaci jsme jako model použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) myší divokého typu nebo myší deficientních v proteinu PAG...
|
|
| |
|
|
Preparation, expression and characterization of mouse GCPIII
Bäumlová, Adriana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent)
Slovenský abstrakt Glutamátkarboxypeptidáza II (GCPII, EC 3.4.17.21) je transmembránovým glykoproteínom II typu, ktorý bol objavený v nervovom systéme na základe degradácie N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamatu na N-acetyl-L-aspartát a L-glutamát, a preto sa predpokladá jeho účasť na nervovej signalizácií. Okrem mozgu, GCPII bola objavená vo väčšej miere taktiež v prostate, obličkách a tenkom čreve. V tenkom čreve GCPII napomáha vstrebávaniu folátov z potravy tým, že odštepuje koncové glutamáty z polyglutamylovaných folátov. V prostate nie je funkcia tohto proteínu doposiaľ známa, avšak využíva sa ako márker rakoviny. Mus musculus je dôležitým modelom pre štúdium GCPII a jej homológov ako terapeutického ciela. Ľudská GCPII a jej paralóg GCPIII sú pomerne dobre charakterizované, zatiaľ čo žiadna biochemická štúdia o ich myších ortológoch nie je dostupná. Preto sme myšaciu glutamátkarboxypeptidázu III (mGCPIII) naklonovali, pripravili rekombinantnou expresiou v hmyzích bunkách a chrakterizovali. Ukázali sme, že mGCPIII vykazujeα-glutamátkarboxypeptidázovú aktivitu, ktorá je inhibovatelná špecifickým inhibítorom GCPII, 2-PMPA. Taktiež sme testovali citlivosť a špecifitu monoklonálnych protilátok voči myšacej GCPIII. Imunochemická detekcia odhalila, že protilátka GCP-04 rozpoznáva ľudskú GCPII rovnako dobre ako...
|
|
|
Topografie signalizačních molekul na plazmatické membráně při aktivaci žírných buněk
Lebduška, Pavel ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent) ; Benada, Oldřich (oponent) ; Tučková, Ludmila (oponent)
|išitmezirůznýmimodeloými zástupcidanéhobuněčnéhotypu.Prezentovaná metodaizolacemembriínoýchlistuz neadherentníchbuněkby mohlavýzkum v tomtooboruusnadnit.Je všaktřebapřipomenout,Žeplastickéhoobrazuo přenosu signálupřesp|azmatickoumembrá'nujemožnodosáhnoutjensouhrouřady rozdilnýchavzájemněse doplňujícíchpřístupů. Závérv By|y vytvořeny tři způsobyizolacemembránových|istůz neadherentních žírnýchbuněk BMMC. Jedenz nich,založenýna adsorpci leukocytů ke sk|eněnémupovrchu,seukázal být zvláštěslibný a poskyt|řadu vědeckých dzt (čIánekE"). Aktivace žírnýchbuněk RBL dimerizacíreceptoruFceRI vedla k obohacení plazmatickémembrány o adaptoroý protein Grb2, který však'na rozdí| od případumultimerizacer€ceptoru' s FcaRI signiíikantněneko|oka|izoval a distribuceFceRI neby|ametodouimunoznačenímembránových|istů odlišitelnáod distribuce na neaktivovanýchbuňkách (čtánekA).Žírnébuňky BMMC' na rozdí|od buněk RBL' netvořily po mu|timerizacireceptoruvětší agregátyFceRI, nežbuňky neaktivované.Mu|timerizace receptoruFcaRI vedla u buněk BMMC a RBL k jeho internalizaci o srovnate|néintenzitěi celkové dynamice,ale lolcilní redistribuceFceRI se u nich zásadně|iši|a(článekE). Vžifýmode|rozsáhlých (přib|ižně200nm) signalizačníchdoméntohoto receptorubyl zpochybněn. Adaptorový protein NTAL by| v p|azmatickémembráně distribuován v...
|
|
| |
|
|
Interakce adenylát cyklasového toxinu s komplementovým receptorem 3 - vztah struktury a funkce
Morová, Jana ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Bezouška, Karel (oponent)
4 ZÁvĚnv Pnoorrxcp rNrEGRrNu CDI t b/CDl g METoDoU WESTERN BLoT pro imunizaci myšía přípravu specifických protilátek. podjednotky CDllb, tak 52 buňky nejsou schopny účinnětransponovat tuto pod.|ednotku na svůjpovrch nebo sekretovatjejí extracelu|ární doménu do média. A to ani v případě, žeje opatřena signálním peptidem specifickým pro tyto buňky. Dále bylo prokázáno, Že pouŽití plasmidů pro konstitutivní nebo inducibilní expresi proteinů nemá vliv na hladinu exprese podjednotky CD l 8. Analysn NTERAKCE RTX roxlNŮ . p, INTEGR|NY _ RoLE GLYKoSYLACE RrcepronŮ vr,vaznři, RTX roxtNťi vyŽaduje glykosylaci integrinového receptoru CDl lb/CDl8' A zároveň bylo ukázáno, Že sniŽení vazby CyaA po odstranění sacharidovéhých řetězců není zpŮsobeno niŽším mnoŽstvím integrinu CDt lb/CDl8 na buněčnémpovrchu nebo jeho rozpadem na .jednotlivé podjednotky CD l t b a CDl 8. sacharidy - chitobiosou' chitotriosou. D-mannosou, N-aceýl|aktosaminem a sia1ovou kyselinou - sacharidy, které jsou obsaženy v N-glykosidicky vázaném oligosacgaridovém řetězci. To ukazu.je na lektinovou aktivitu CyaA. receptoru CD I l b/CD l8, která urču.je vazbu CyaA. aktivitě da|šíchRTX toxinů. l5 IMUNoLoG|CKÉ vYUŽlTí CyaA .lnxo NostČr, PRo DoPRAvtl MYKoBAKrnRIÁI-nicg EPIToPŮ Do ANT|GEN PREZENTI)JÍCicH sttNĚx epitop oVA:257.264 (pozice l08) na molekulách...
|
|
|
Virulence of Bordetella pertussis from an Omics Perspective
Novák, Jakub ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Gram-negativní aerobní kokobacilus Bordetella pertussis je jedním z nemnoha výhradně lidských patogenů a hlavním původcem respiračního onemocnění zvaného pertuse, nebo také černý kašel. Navzdory globálním vakcinačním programům představuje pertuse stále významný problém pro veřejné zdraví - ročně padne za oběť tomuto onemocnění po celém světě na sto tisíc dětí a celkové počty hlášených případů dosahují desítek milionů. Také proto je výzkumu mechanismů působení faktorů virulence bakterie B. pertussis věnována významná pozornost. Navzdory tomu však zůstává biologie interakcí této bakterie se svým lidským hostitelem z velké části neznámá nebo jen málo prozkoumaná. Evoluce, genetika a adaptace B. pertussis komplexnímu prostředí lidského nosohltanu spolu s procesy umožňujícími této bakterii obejít hostitelské obranné mechanismy, ať už vrozené, tak i získané imunity, jsou doposud jen částečně popsány a pochopeny. V tomto kontextu představují omics přístupy velmi cenné nástroje k odhalení doposud neznámých aspektů interakcí mezi hostitelem a patogenem a otevírají tak cestu detailnější analýze regulace virulence pomocí mechanistických studií. V této práci představuji výsledky tří omics projektů věnovaných biologii B. pertussis, postavených alespoň zčásti na tzv. high-throughput proteomických přístupech. V...
|
|
| |
|
|
Phosphatidylserine and phospholipid scramblase in mast cell signaling
Smrž, Daniel ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Bezouška, Karel (oponent) ; Šebo, Peter (oponent)
6. CONCLUSIONS 1. We found that mast cell stimulation can induce PS externalization in the absence of secretory response. 2. We identified GPI-APs as molecules whose engagement can induce sustained and reversible non-apoptotic PS externalization. 3. GPI-AP-induced PS externalization was determined as non- apoptotic and distinct from the FceRl-induced PS externalization. 4. The effect of multiple triggering on PS externalization was additive and dependent on a tlpe of stimulus and cells engaged. 5. We identifred PLSCR1 as a molecule that becomes tyrosine phosphorylated in mast cells stimulated through GPI-APs. 6. We found that the PLSCR1 tyrosine phosphorylation is not associated with mast cell secretory response' and with GPI-AP- or FceRl-induced non-apoptotic PS externalization. 7. Using confocal microscopy and electron microscopy visualization of PLSCR1 in the course of mast cell activation we found that PLSCR1: (1) is not co-localized with extemalized PS, (2) is not co- localized with aggregated Thy-l.l or FceR[, and (3) does not form self-aggregates. 8. We děřelóped a modifred one-tube semi-nested PCR-ELISA. The modified assay showed higher sensitivity and specificity than the conventional hybridization-based and a modified semi-nested- based PCR-ELISA. Due to its versatility and robustness, the...
|
host ::
RSS.