|
|
Vliv teploty a vlhkosti kultivačních boxů na metabolismus rostlin kostřavy (Festuca rubra)
Vaverová, Kateřina ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Synková, Helena (oponent)
Faktory životního prostředí jako je dostupnost vody, živin, teplota a sluneční záření ovlivňují růst a metabolismus rostlin. Populace rostlin kostřavy (Festuca rubra L.) ze čtyř stanovišť v Norsku lišících se nadmořskou výškou, průměrnou teplotou a množstvím srážek byly pěstovány v klimatizovaných boxech lišících se teplotou a vlhkostí. Ve vzorcích listů těchto rostlin byla stanovena aktivita Rubisco, aktivita šikimátdehydrogenázy a množství proteinů. Specifická aktivita Rubisco byla nejnižší v listech rostlin kostřavy pěstované za podmínek sucha a zvýšené teploty, statisticky výrazné rozdíly mezi jednotlivými stanovišti a podmínkami pěstování však nebyly zjištěny. Specifická aktivita šikimátdehydrogenázy byla naopak za podmínek sucha a zvýšené teploty nejvyšší. Izoenzymové složení bylo testováno pomocí nativní elektroforézy. Klíčová slova: Rubisco, šikimátdehydrogenáza, abiotický stres rostlin
|
|
|
Možnosti přípravy lidských glykoproteinů v semenech luštěnin
Ploužková, Tereza ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Exprese rekombinantních proteinů v semenech je výhodná zejména kvůli vysoké koncentraci zásobních proteinů v malém objemu. Rekombinantní proteiny se v semenech akumulují ve vysokých koncentracích, zůstávají stabilní řadu let a díky nízkému obsahu alkaloidů a dalších látek nejsou semena náročná na další zpracování. Mezi další výhody řadíme minimální riziko kontaminace. Bakalářská práce se zabývá testováním transientní exprese genových konstruktů přímo v dozrávajících semenech sóji. V rámci této práce byly připraveny genové konstrukty pro testování transientní exprese genu uidA. Také byl studován vliv aditiv acetosyringonu a dithiothreitolu a jejich kombinací na transientní expresi a aktivitu genu uidA. Dále byla studována optimální délka a prostředí sonikace. Na závěr byla také porovnána účinnost transientní exprese metodou in vitro a in vivo. Bylo potvrzeno, že acetosyringon má pozitivní vliv pouze na semena, která nebyla předem sonikována. S prodlužující se sonikací klesá relativní aktivita genu uidA. Dále byl zjištěn pozitivní vliv dithiothreitolu u nesonikovaných semen. Vyšší hodnoty sledované relativní aktivity genu uidA byly také zaznamenány po přidání obou aditiv do infiltračního pufru. Jako optimální délka sonikace byla zjištěna 30 s sonikace v případě metody in vitro a 60 s u in vivo...
|
|
|
Proteiny jako zdroj dusíku pro rostliny tabáku pěstované in vitro
Bělonožníková, Kateřina ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Dusík (N) patří mezi nepostradatelné prvky pro růst a vývoj rostlin. Dříve byla pozornost soustředěna hlavně na jeho anorganické formy - dusičnany a amonné kationty. V půdě je N přítomen také v organické formě, kterou představují i proteiny, o které mohou rostliny soutěžit s půdními mikroorganismy. V současné době jsou zvažovány dva mechanismy - hydrolýza proteinů sekretovanými proteasami a endocytóza nativních proteinů, případně jejich souhra. Rostliny tabáku byly pěstovány in vitro za sterilních podmínek v modifikovaném Murashige- Skoogově médiu s kaseinem jako jediným zdrojem N (KAS), se sníženou koncentrací anorganických forem N (AD) nebo v kompletním Murashige-Skoogově médiu jako kontrolní rostliny (MS). Po 12 týdnech růstu byly změřeny standardní růstové parametry rostlin. KAS rostliny byly schopné růst bez přítomnosti anorganické formy N, a obsah proteinů v listech byl vyšší než v ostatních experimentálních rostlinách. Proteomická analýza ukázala rozdíly v expresi proteinů v kořenech rostlin v závislosti na formě N v kultivačním médiu. Celkově bylo identifikováno 185 proteinů, z nichž 75 % procent proteinů bylo méně a 14 % více abundantních v KAS rostlinách. Příjem konjugátu kaseinu s fluoresceinem rostlinami a jejich proteolytická aktivita byla analyzována konfokální mikroskopií. Mezi...
|
|
|
Studium proteinů spermií různých savčích druhů
Pohlová, Alžběta ; Postlerová, Pavla (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Rozmnožování je základní charakteristikou všech zvířat a nezbytným krokem k produkci nové generace. Studium proteinů spermií je rozhodující pro pochopení vzájemného rozpoznání spermie a vajíčka. Zabývali jsme se povrchovými proteiny, které se podílejí na vazbě na zona pellucida a zkoumali, zda jsou tyto proteiny zachovány v rámci savčích druhů. Nepřímá imunofluorescenční mikroskopie byla použita k testování panelu monoklonálních protilátek, které byly připraveny proti povrchovým proteinům spermií prasete, na býčích a myších spermiích. Byla nalezena zkřížená mezidruhová reaktivita některých protilátek proti kančím spermiím na ejakulovaných spermiích býka a na epididymálních spermiích myši. Dále jsme izolovali proteiny spermií různých savčích druhů: prasete, býka, psa, kocoura, myši a člověka. Proteiny byly separovány elektroforeticky v přítomnosti SDS a byly porovnány proteinové a glykoproteinové profily epididymálních, ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermií. Interakce spermií se zona pellucida byly studovány na elektroforeticky separovaných povrchových proteinech spermií prasete a býka reakcí s biotinem- značenými glykoproteiny zona pellucida. Protilátky značící povrchové proteiny kančích spermií se zona pellucida vázající aktivitou byly použity ke sledování původu daného proteinu v...
|
|
|
Oxidační poškození buněčných komponent po indukci oxidačního stresu specifickými herbicidy
Kramná, Barbara ; Wilhelmová, Naďa (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
1. Abstrakt Oxidační stres je způsoben nadměrnou produkcí a akumulací ROS (reaktivních forem kyslíku) a je častým důvodem buněčného poškození za nepříznivých environmentálních podmínek, např. za sucha, chladu, zasolení. Ve své práci jsem využila specifického působení herbicidů MV (methyl viologen) a 3-AT (3-aminotriazol) k přímé indukci oxidačního stresu u rostlin tabáku (Nicotiana tabacum cv. Xanthi). Míra oxidačního poškození byla sledována na úrovni DNA pomocí kometového testu, dále na peroxidaci lipidů, hladině karbonylovaných proteinů a modifikaci aktivit antioxidačních enzymů CAT (katalázy) a APX (askorbátperoxidázy). Konfokální fluorescenční mikroskopie zdokumentovala změnu redoxního stavu buněk po aplikaci herbicidů a při vyšších koncentracích byl pozorovaný signál specificky lokalizován do peroxizómů. Použité herbicidy působily v řádově odlišných koncentracích, MV v µM a 3-AT v mM a oba způsobily výrazné poškození jaderné DNA. Jako další průkazný marker oxidačního stresu po aplikaci MV se ukázala být karbonylace proteinů. Inhibice antioxidačních enzymů CAT a APX byla oproti 3-AT méně výrazná. Klesající stabilita membrán se ukázala být univerzálním markerem oxidačního poškození pro oba herbicidy, zatímco peroxidace lipidů byla neprůkazná. MV a 3-AT mají rozdílné módy účinku, a každý působí na...
|
|
|
Isolation and study of proteins with zona pellucida binding activity
Zigo, Michal ; Postlerová, Pavla (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent) ; Antalíková, Jana (oponent)
Vazba spermie na vajíčko je zprostředkována komplementárními molekulami na povrchu obou gamet a zahrnuje interakci proteinových receptorů spermie se sacharidovými strukturami zona pellucida (ZP). Ukázalo se, že do interakce spermie se ZP je zapojeno mnoho proteinových receptorů a potenciální primární receptory spermie pro vazbu na glykoproteiny ZP byly zkoumány u různých savců. Většina proteinů spermie, u kterých byla zjištěna vazebná aktivita se ZP, patří k proteinům plazmatické membrány. Nicméně přesné metody pro izolaci membránových proteinů spermie nejsou doposud standardizovány. Tato práce je zaměřena na využití různých izolačních protokolů, které vedou k získání extraktů odlišného proteinového složení. Dále jsou zahrnuty dva možné přístupy pro odhalení nových potenciálních vazebných receptorů spermií pro primární vazbu se ZP a jejich identifikace. Proteiny z ejakulovaných a in vitro kapacitovaných kančích spermií byly izolovány za použití různých extrakčních postupů: Triton X-100, Triton X-114, kyselina octová, dodecylsulfát sodný (SDS), N-oktyl-β-D-glukopyranosid (OBG), rehydratační pufr (RHB) a nakonec extrakcí pomocí zmrazení a následného tání. Tyto proteinové extrakty byly charakterizovány pomocí 1-D a 2-D proteinových profilů, barvením na glykoproteiny a substrátovými zymografickými...
|
|
|
Vlastnosti rostlinných extraktů
Bělonožníková, Kateřina ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Liberda, Jiří (oponent)
Rostliny syntetizují řadu látek označovaných jako sekundární metabolity. Patří mezi ně produkty fenylpropanoidní dráhy (flavonoidy, stilbeny, anthokyaniny, taniny), isoprenoidy a alkaloidy. Studiu sekundárních metabolitů rostlin je věnována značná pozornost, protože jsou spojovány s pozitivním vlivem na lidské zdraví a snížením rizika některých chorob včetně rakoviny, diabetu 2. typu a poruch kardiovaskulárního systému. Mechanismus účinku jednotlivých látek není dosud přesně znám, pozitivně se projevuje jejich antioxidační kapacita. V této práci byly připraveny extrakty z 22 druhů ovoce a zeleniny, byl stanoven celkový obsah fenolických látek, flavonoidů a antioxidační kapacita pomocí metody FRAP (z angl. ferric ion reducing antioxidant power) a ABTS [2,2' -azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6- sulfonát)]. Vysoký obsah fenolických látek byl zjištěn v extraktu z jahody, višně a kiwi. Nejvyšší antioxidační kapacitu měl extrakt z jahody. Další sledovanou vlastností byl vliv extraktů z ovoce a zeleniny na aktivitu trávicích enzymů pankreatické lipasy a α-amylasy. Extrakt z citronu, červeného rybízu, josty, limetky a višně snížil aktivitu lipasy, extrakty z červeného rybízu, dýně, kiwi a nashi výrazně inhibovaly štěpení škrobu α-amylasou. Klíčová slova: fenolické látky, flavonoidy, antioxidační kapacita,...
|
|
|
Výskyt purinergních receptorů P2 a jejich úloha v intracelulární vápníkové signalizaci neonatálních hypofyzárních buněk
Šprláková, Katarína ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Tato diplomová práce je zaměřena na studium výskytu purinergních receptorů P2X a P2Y v buňkách neonatální adenohypofýzy. Purinergní receptory jsou aktivovány navázáním extracelulárního ATP a jejich aktivace vede k zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých iontů. Cílem této práce bylo metodou mikrofluorimetrie zjistit, jestli neonatální hypofyzární buňky obsahují purinergní receptory. Také byl sledován vliv různých agonistů a antagonistů purinergních receptorů na intracelulární koncentraci iontů Ca2+ v buňkách neonatální hypofýzy. Radioimunologickým měřením byl sledován účinek extracelulárního ATP na sekreci luteinizačního hormonu a porovnán s účinkem hormonu GnRH. V práci bylo zjištěno, že neonatální buňky hypofýzy jsou na přítomnost extracelulárního ATP méně citlivé než buňky dospělé hypofýzy, ale relativní citlivost k dalším agonistům purinergních receptorů je podobná jako u dospělé hypofýzy. Ve smíšené populaci neonatálních hypofyzárních buněk byly identifikovány purinergní receptory P2X citlivé k ATP a 2 MeSATP, jako i receptory P2Y citlivé k ADP. Dále byly identifikovány receptory P2X7 citlivé k BzATP, receptory P2X2 reagující na PPADS a receptory P2X4 reagující na BDBD. Nakonec bylo prokázáno, že extracelulární ATP může i v nepřítomnosti hormonu GnRH zvyšovat bazální sekreci...
|
|
|
Nové analogy peptidu uvolňujícího prolaktin s prodlouženým účinkem na příjem potravy
Tichá, Anežka ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent)
Peptid uvolňující prolaktin (PrRP) patří k tzv. RF-amidovým peptidům, pro které je typická C-koncová sekvence -Arg-Phe-NH2. Díky vzájemné podobnosti mají tyto peptidy obdobné biologické účinky. PrRP byl objeven při hledání endogenního ligandu k sirotčímu receptoru GPR10, když byl hledán faktor zodpovědný za sekreci prolaktinu. Tento účinek byl brzy zpochybněn a v současnosti je PrRP považován především za anorexigenní peptid. To dosvědčuje i fakt, že se u myší s vyřazeným genem pro PrRP nebo GPR10 vyskytuje hyperfagie a obezita. Kromě GPR10 se PrRP váže s vysokou afinitou i k receptoru NPFF2, jehož endogenním ligandem je rovněž anorexigenní neuropeptid FF (NPFF). V této práci byl zkoumán vliv navázání různě dlouhých mastných kyselin na N-konec na biologickou aktivitu PrRP, a to in vitro ve vazebných experimentech a spouštění signalizační dráhy MAPK/ERK1/2 v závislosti na koncentraci peptidu. V in vivo experimentech testujících vliv periferně podaných analogů na příjem potravy byl testován potenciální anorexigenní účinek lipidovaných analogů PrRP, který je centrální, a proto předpokládá přestup analogu PrRP přes hematoencefalickou bariéru. Vazebnými testy bylo zjištěno, že všechny analogy se vážou k potkaní hypofyzární buněčné linii RC-4B/C s velkou afinitou, analogy s navázanou mastnou kyselinou...
|
|
|
Fytohormony produkované askomycetou Leptosphaeria maculans jako efektory ovlivňující signální dráhy rostlin
Krutinová, Hana ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Leptosphaeria maculans je patogenní houba způsobující fómové černání stonků řepky Brassica napus. V rámci této práce bylo zjištěno, že L. maculans produkuje in vitro řadu fytohormonů a dále se soustředila se na auxiny a brassinosteroidy. Z auxinů byla v myceliu nejvíce zastoupena IAA a její oxidační produkt OxIAA. Složení kultivačního media významně ovlivňuje zjištěnou koncentraci IAA. Přítomnost extraktu z rostlin Brassica napus v kultivačním mediu zvyšuje koncentraci IAA. V rostlinách, infikovaných L. maculans, byla zjištěna zvýšená koncentrace OxIAA oproti kontrolním rostlinám ošetřeným vodou. Byly zjištěny významné odlišnosti v produkci IAA mezi dvěma použitými sesterskými izoláty JN2 a JN3. V chemicky definovaném mediu Gamborg JN2 neprodukuje téměř žádnou IAA, JN3 produkuje IAA v koncentraci asi 1000 pmol/g čerstvé hmotnosti. Tato odlišnost byla využita jako model pro studium exprese genů biosyntetické dráhy auxinů v L. maculans. Tyto geny byly nalezeny na základě homologie s geny Arabidopsis thaliana (YUCCA1.1 a NIT1.2) a Ustilago maydis (IAD1.2 a TAM1-2.1). Pomocí ošetření prekurzory IAA (tryptofan a tryptamin) byla v izolátu JN2 pozorována zvýšená transkripce kandidátních genů biosyntézy auxinů. Po ošetření JN2 kultury tryptofanem a tryptaminem se zvýšila produkce IAA. U JN3 nebyla...
|
host ::
RSS.