|
| |
|
|
Imunologické testování kombinovaných LELTE / sacharidových dendrimerů
Kádek, Alan ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Man, Petr (oponent)
Imunologické testování kombinovaných LELTE / sacharidových dendrimerů. Alan Kádek (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Česká republika) CD69 je široce rozšířený receptor buněk imunitního systému. Přestože jeho fyziologický ligand není dosud znám, byla v Laboratoři architektury proteinů zjištěna jeho afinita k řadě látek včetně vápenatých iontů, sacharidů a záporně nabitých látek jako jsou karboxylované kalixareny. Nedávno byla též jako ligand CD69 identifikována pentapeptidová sekvence LELTE, pocházející z mykobakteriálního chaperoninu Hsp65, která představuje pro imunitní systém signál o nebezpečí. Tento peptid ovšem není imunoaktivní samostatně, ale pouze při prezentaci v multivalentním prostředí Hsp65 proteinu nebo po umělé dimerizaci za použití bi- či polyfunkčních činidel. V předkládané práci zkoumám u čtyř nově syntetizovaných látek jejich in vitro immunologické efekty na buněčnou signalizaci, proliferaci, přirozené zabíjení nádorových buněk a na indukci apoptosy v imunocytech. Testované látky prezentují LELTE peptid připojený skrze ε-aminoskupiny lysinů na cyklopeptidické RAFT kostře (K-K-K-P-G)2, a to jak samostatně, tak v kombinaci se sacharidovým epitopem α-GalNAc. Schopnost těchto látek aktivovat lidské PBMC lymfocyty je zejména zvýšená u látek,...
|
|
|
Exprese rekombinantní formy nepenthesinu I z Nepenthes gracilis.
Tretyachenko, Vyacheslav ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Košek, Dalibor (oponent)
Nepenthesin je nespecifickou aspartátovou proteasou láčkovek Nepenthes a Drosera. Přírodní forma se vyznačuje vysokou termostabilitou a odolnosti v širokém rozmezí pH, vlastnostmi, které dovolují použití enzymu pro účely experimentu vodík/deuteriové výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Navzdory těmto charakteristikám se ukázalo, že proteasa má relativně nízkou stabilitu vůči denaturačním činidlům (močovina, guanidinium chlorid). Pro vysvětlení tohoto fenoménu je třeba strukturně-funkční analýzy, která dosud nebyla možná z důvodu nízkého množství izolovaného enzymu z láček a jeho dodatečné glykosylace. Cílem této práce bylo připravit aktivní rekombinantní formu nepenthesinu v dostatečném množství pro možnost jeho rutinního využívání v experimentech vodík/deuteriové výměny a pro jeho charakterizaci prostřednictvím rentgenstrukturní analýzy.
|
|
|
Validace/verifikace diagnostik v onkohematologické laboratoři.
Špulková, Adéla ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Poljaková, Jitka (oponent)
Se současným vývojem společnosti se rozvíjí i veškeré oblasti vědy a nejen jí. Jsou tak kladeny čím dál tím větší požadavky na práci lidí, na používané metody a techniky. Neustále se objevují nové léky, nové postupy při diagnostice. S tím vším souvisí i potřeba ověřovat, zda vše funguje tak, jak má, zda měření plní požadavky, které jsou na něj kladené. K tomuto účelu je tedy třeba vše validovat/verifikovat. Validace metod je zároveň jedním z požadavků norem ISO. Validace/verifikace, konkrétně diagnostik v onkohematologické laboratoři, je tématem této bakalářské práce. Ta se v teoretické části věnuje vymezení základních pojmů souvisejících s molekulární genetikou, imunitním systémem a prací v klinické laboratoři, včetně používaných metod. Experimentální část je zaměřena na využití validace v praxi, a to akreditovanou laboratoří Ústavu hematologie a krevní transfúze. Hlavními cíly byla validace nových kitů HLA- SuBiTo, validace kitu PowerPlex CS7 System a validace bialelického sekvenčního polymorfismu G42863. Každý z těchto stanovených cílů byl specifický a byl proveden s odlišným účelem a postupem, čímž se potvrdilo, že validace (verifikace) je nedílnou součástí práce v klinických laboratořích a její využití je velice rozmanité. Klíčová slova Alela, deoxyribonukleová kyselina, hlavní...
|
|
|
Studium struktury a dynamiky proteinů a proteinových komplexů.
Vaňková, Pavla ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
4 Abstrakt Proteiny v buňce dosahují své nativní konformace za asistence molekulárních chaperonů. Tyto vysokomolekulární dynamické komplexy kromě toho vykonávají další funkce přispívající ke stabilitě buněčného proteomu. Řadí se mezi ně mimo jiné i transport proteinů do cílového kompartmentu nebo obrana proti oxidativnímu stresu. Dynamické strukturní změny chaperonů Hsp70 a NQO1 a ko-chaperonu Tomm34, jež se podílejí na výše zmíněných procesech, a jejich interakce s ligandy jsou zde charakterizovány kombinací strukturní hmotnostní spektrometrie, biofyzikálních a molekulárně biologických technik. V této práci byla popsána ATP-dependentní dimerizace lidské inducibilní formy Hsp70 (HSPA1A) a charakterizováno evolučně konzervované dimerizační rozhraní. Dále byly identifikovány vysoce konzervované aminokyselinové zbytky, které vytvářejí síť kontaktů stabilizující obě krajní konformace HSPA1A (nízko- i vysokoafinitní) v průběhu ATPasového cyklu. Jedním z ko-chaperonů ovlivňujících ATPasový cyklus Hsp70 je TPR ko-chaperon Tomm34 spolupodílející se na transportu jádrem kódovaných mitochondriálních prekurzorů do mitochondrií. Zde je popsán význam jeho fosforylace cAMP-dependentní proteinkinasou A a následná interakce s proteinem 14-3-3γ při regulaci tohoto procesu. V případě chaperonu NQO1, který má kromě...
|
|
|
Structural characterization of biotechnologically and medicinally important proteins.
Filandr, František ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Škultéty, Ľudovít (oponent)
Velké množství biologických procesů je závislé na strukturní dynamice proteinů a specifických protein-proteinových, nebo protein-ligandových interakcích závislých na specifických podmínkách uvnitř, či vně buněk. Analýza struktury proteinů klasickými metodami jako je rentgenová krystalografie, NMR, nebo nově cryo-EM poskytuje důležité struktury s atomárním rozlišením, avšak většinou ukazuje pouze statický obrázek bez detailů o dynamice, nebo transientních interakcích, a navíc často v nenativních podmínkách. Tyto detaily může doplnit strukturní hmotnostní spektrometrie, která umí poskytnout informace o proteinové dynamice, interakcích proteinů s jinými molekulami a také o specifických meziatomových vzdálenostech v samotných proteinech, nebo mez interakčními partnery, to vše při relativně nativních podmínkách. V této práci byla použita vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS), klasická proteomická analýza a turbidimetrie ke studiu biotechnologicky užitečných proteinů houbového celulolytického systému lytické polysacharidové monooxygenasy (LPMO) a celobiosadehydrogenasy (CDH) a rovněž fotosensitivní domény LOV2 pocházející z rostlinného fototropinu využitelné při fotodynamické terapii. Pomocí těchto metod byla sledována celulolytická reakce katalyzovaná redukovaným enzymem...
|
|
|
Malé a střední podniky na trhu veřejných zakázek v České republice
Man, Petr
Disertační práce se zabývá oblastí zadávání veřejných zakázek v České republice v kontextu její právní úpravy, analyzuje proces zadávání veřejných zakázek jak na straně zadavatelů, tak i na straně dodavatelů. Hlavním cílem disertační práce je identifikovat, zda malé a střední podniky mají rovné postavení na trhu veřejných zakázek v České republice. Jako dílčí cíle si autor vytyčil identifikaci faktorů ovlivňujících veřejné zakázky z pohledu efektivního vynakládání veřejných prostředků ze strany zadavatelů a dopad této efektivity na intenzitu konkurence, identifikace podmínek účasti MSP ve veřejných zakázkách, bariéry vstupu a úspěchu při získávání veřejných zakázek, analýza volby hodnotících kritérií na straně zadavatele při zadávacích řízeních a definice dopadů dle jejich konkrétní volby zadavatelem na úspěšnost MSP v soutěži a dále komparaci právních úprav upravujících oblast zadávání veřejných zakázek v České republice z hlediska zákona č. 137/2006 Sb., o veřejných zakázkách a zákona č. 134/2016 Sb., o zadávání veřejných zakázek a v návaznosti na to určitá doporučení pro zadavatele při zadávaní veřejných zakázek vedoucí k posílení účasti a úspěšnosti malých a středních podniků v zadávacích řízeních. Teoretická část je věnována analýze současnému stavu řešené problematiky v oblasti zadávání veřejných zakázek v České republice. Je zde položen základ pro identifikaci hlavních problémů a možností jejích řešení. Plnění vytčených cílů bylo provedeno v několika etapách. Nejprve autor v rámci provedené analýzy faktorů ovlivňujících trh veřejných zakázek vyslovil závěr, že MSP se musejí potýkat s celou řadou problémů, které jim aktivní účast v soutěži o veřejné zakázky ztěžují, a to jak bariérami přirozenými, tak i legislativními. V rámci identifikace faktorů ovlivňujících veřejné zakázky v České republice vyslovil autor závěr, že zvýšení počtu podaných nabídek v zadávacím řízení kladně ovlivňuje výši nabídkové (vysoutěžené) ceny, jakož i na silnou závislost mezi nabídkovou (vysoutěženou) cenou a předpokládanou hodnotou veřejné zakázky, což může determinovat efektivitu zadávacího procesu. Dále jsou v práci uvedena některá doporučení adresovaná zadavatelům, směřující ke zjednodušení zadávacího procesu a k vytvoření soutěžního prostředí příznivého pro aktivní účast MSP v boji o atraktivní trh veřejných zakázek. Na základě provedené analýzy práce uvádí, že kritérium nejnižší nabídkové ceny může být, za jistých okolností, pro MSP nepříznivé, a to z důvodů menší ekonomické stability oproti velkým podnikům. V rámci komparace právních úprav upravujících oblast zadávání veřejných zakázek v České republice je uvedeno, že nová pravidla, která byla do našeho právního řádu implementována prostřednictvím směrnic EU jsou přínosem pro všechny aktéry na trhu veřejných zakázek.
|
|
|
Vývoj alternativních proteolytických postupů pro identifikaci proteinu
Jirečková, Barbora ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Hnízda, Aleš (oponent)
4 Abstrakt Metody výzkumu proteinů založené na hmotnostní spektrometrii přibývají v posledních letech na svém významu. Pro takzvaný bottom-up přístup je zásadní proteolytický krok, který určuje úspěšnost a relevanci identifikace a charakterizace proteinu, sekvenční pokrytí a ve vodík/deuteriové výměně spojené s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) prostorové rozlišení. Běžně používané proteázy mají ale své limitace. Z tohoto důvodu je snahou najít alternativy, které mají především jiné štěpné preference a aktivitní profil. AnPEP proteáza (prolyl endoproteáza z Aspergillus niger) je výhodná v tom, že je možné ji získat komerčně ve velkém množství a vyznačuje se štěpením za prolinem, v blízkosti kterého mnohé proteázy neštěpí. Tato práce se zabývá optimalizací štěpení AnPEP proteázou získanou z komerčního preparátu Gluten Rid with Tolerase G. Nejprve bylo provedeno štěpení AnPEP proteázou za různých podmínek na modelovém proteinu (bovinní karbonická anhydráza 2) a snahou bylo zjistit, jak se při změně podmínek (teploty, pH, koncentrace proteázy na nosiči nebo v roztoku) mění efektivita štěpení a štěpné preference této proteázy. Provedené experimenty ukázaly, že je AnPEP vhodný pro vodík/deuteriovou výměnu spojenou s hmotnostní spektrometrií v imobilizované formě i v roztoku. Naopak méně vhodný je z důvodu...
|
|
|
Binding of eIF3 in complex with eIF5 and eIF1 to the 40S ribosomal subunit is accompanied by dramatic structural changes
Zeman, Jakub ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Štefl, Richard (oponent) ; Man, Petr (oponent)
Eukaryotické iniciační faktory (eIF) jsou pro průběh eukaryotické translace minimálně stejně důležité jako ribosom. Některé tyto faktory mají rozdílné úlohy napříč celou translací v zajištění korektního složení preiniciačního komplexu na mRNA, přesném výběru iniciačního kodonu, bezchybné produkci příslušného polypeptidu a jejím řádném ukončení. Patrně nejdůležitějším z těchto faktorů je eIF3, který integruje signály od ostatních faktorů a koordinuje jejich funkci na ribosomu. V případě Saccharomyces cerevisiae je eIF3 tvořen pěti podjednotkami. Všechny tyto podjednotky obsahují strukturní motivy zodpovědné za kontakt s ribosomálními proteiny a molekulami RNA. Kromě těchto vysoce strukturovaných částí je zbytek eIF3 nestrukturovaný a velmi flexibilní. Z toho důvodu nejsou i přes současný pokrok v kryoelektronové mikroskopii doposud známy ani přesná struktura eIF3, ani jeho přesná poloha na ribosomální podjednotce 40S. Rovněž přítomnost eIF3 na ribosomu 80S během časné elongace a role eIF3 v reiniciaci a pročítání stop kodonu nejsou zatím zcela prostudovány. K rozluštění těchto tajemství eIF3 jsme použili rentgenovou krystalografii, chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií a rozličné biochemické a genetické metody. Naše práce ukazuje, že je eIF3 velmi kompaktně sbalený, pokud se nachází...
|
|
|
Eukaryotické exprese kyselých proteas.
Vodolánová, Lucie ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Nepenthesin I a neprosin jsou kyselé proteasy, které se přirozeně vyskytují v trávicích šťávách masožravých rostlin rodu Nepenthes. Oba enzymy jsou syntetizovány jako zymogeny, které jsou aktivovány v kyselém prostředí. Díky svým vlastnostem a štěpným preferencím jsou vhodné pro studium proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie či jako doplněk bezlepkové diety při celiakii. Protože v trávicích šťávách rostlin Nepenthes se vyskytují v nízké koncentraci a prokaryotický expresní systém nevykazoval uspokojivé výsledky, je snaha o nalezení vhodnějšího expresního systému pro produkci jejich rekombinantních forem, který by produkoval enzymy se stejnými vlastnostmi jako ty přírodní a zároveň poskytoval vysoké výtěžky. Cílem této práce je příprava expresních vektorů s geny nepenthesinu I a neprosinu pro transfekci do eukaryotických expresních systémů buněk S2 a HEK 293. Klíčová slova: kyselé proteasy, nepenthesin I, neprosin, expresní vektory
|
host ::
RSS.