|
|
Teoretická studie enzymů spojených s procesem karcinogeneze: DNA polymerázy β a cytochromů P450
Jeřábek, Petr ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Ettrich, Rüdiger (oponent)
Disertační práce přispěla k poznání funkce dvou typů enzymů participujících na procesech karcinogeneze, DNA polymerázy (pol ) a cytochromů P450 (CYP). Pol je součástí opravného systému DNA "Base Excision Repair" (BER), kde tento enzym provádí vkládání nového nukleotidu do řetězce DNA na základě párování s bází templátového řetězce. Mutované formy pol byly nalezeny v 30% lidských tumorů, což ukazuje na její důležitou úlohu v procesu karcinogeneze. V disertační práci byly studována schopnost pol rozlišovat mezi "správnou" a "špatnou" bází v průběhu jejího vkládání do DNA, tzv. "fidelitu" (přesnost přiřazení "správného" nukleotidu, v duchu pravidel komplementarity). K tomu byly využity metody počítačového modelování, vhodné pro porovnání energetických rozdílů mezi komplexy obsahující "správnou" a "špatnou" bází. Použita byla metoda výpočtu volných energií LRA. Výsledky signalizují, že jeden z hlavních příspěvků k celkové "fidelitě" pol spočívá v lepší stabilizaci tranzitního stavu nukleofilní substituce "správné" báze, oproti "špatné". Tento rozdíl přispívá 80-ti násobkem k celkové "fidelitě"¨ tohoto enzymu. Identifikovány byly i strukturní prvky, které jsou důležité pro "fidelitu" pol i katalýzu tohoto enzymu. Pro studium sledující vliv mutací na "fidelitu" pol byly použity metody FEP...
|
|
|
Modelování interakcí cytochromů P450 s flavodoxinem
Culka, Martin ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Cytochromy P450 jsou různorodá skupina hemových enzymů vyskytujících se u vět- šiny organismů na Zemi. U lidí zasahují např. do metabolismu cizorodých látek, bakterie jsou schopné díky nim metabolizovat různé hydrofobní substráty. Obecnou reakcí kata- lyzovanou cytochromy P450 je monooxygenace, tedy vnesení jednoho atomu z molekuly kyslíku do substrátu a redukce druhého za vzniku vody. Pro redukci kyslíku je třeba dodávat elektrony, jako donor elektronů u eukaryot obvykle slouží NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa či cytochrom b5, u bakterií však donorem elektronů bývají malé FeS proteiny a flavoproteiny Již dříve bylo ukázáno, že bakteriální donor elektronů fla- vodoxin je schopen dodávat elektrony některým lidským cytochromům P450 in vitro. V této práci jsem se snažil ověřit hypotézu, že flavodoxin je zodpovědný za redukci vybraných lidských (1A2, 2A6, 2A13, 2C9, 2C19, 3A4) a bakteriálních (101A1 a 176A1) cytochromů P450 heterologně exprimovaných v buňkách Escherichia coli. Ke studiu byly použity techniky molekulového modelování. Byla navržena sada možných orientací komplexu jednotlivých cytochromů P450 s flavodoxinem metodou řízeného "dockingu a následně byla ověřena stabilita těchto komplexů řízenou disociací. Byly vybrány nejstabilnější orientace pro každý cytochrom P450, ty byly dále optimalizovány...
|
|
|
Oxidace ellipticinu lidskými cytochromy P450 exprimovanými v prokaryotním a eukaryotním systému
Vejvodová, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Ellipticin, protinádorový alkaloid, představuje léčivo, jehož mechanismus účinku je založen na interkalaci do DNA, inhibici topoisomerasy II a na tvorbě kovalentních aduktů s DNA prostřednictvím enzymové aktivace cytochromy P450 a/nebo peroxidasami. Ellipticin je oxidován cytochromy P450 až na pět metabolitů (7-hydroxy-, 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu). Z těchto metabolitů jsou 9-hydroxy- a 7- hydroxyellipticin považovány za detoxikační metabolity, zatímco 12-hydroxyellipticin, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu za aktivační metabolity, které jsou zodpovědné za tvorbu kovalentních aduktů s DNA. V diplomové práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotním (SupersomesTM ) a dvou prokaryotních expresních systémech (Bactosomes) v oxidaci ellipticinu. Cytochromy P450 exprimované v prokaryotních systémech se lišily v množství "koexprimované" NADPH:CYP reduktasy. Vzniklé metabolity ellipticinu byly analyzovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské cytochromy P450 CYP2C9/2D6/2C19 exprimované v prokaryotním nebo eukaryotním systému oxidují ellipticin za vzniku až čtyř metabolitů: 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13-hydroxyellipticinu and N2 -oxid ellipticinu. Jejich účinnost se ale...
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
|
|
Mechanismus karcinogenity a nefrotoxicity aristolochových kyselin
Bárta, František ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Aristolochové kyseliny (AA) jsou lidskými karcinogeny, které rovněž vykazují silné nefrotoxické vlastnosti. Směs AA je obsažena v rostlinách čeledi podražcovitých (Aristolochiaceae), které byly a nadále jsou užívány v tradiční medicíně, zejména v Asii. Aristolochové kyseliny se podílí na vzniku dvou typů nefropatií. Jedna z nich dokonce nese označení nefropatie vyvolaná aristolochovou kyselinou (Aristolochic Acid Nephropathy, AAN). Druhým onemocněním je balkánská endemická nefropatie (Balkan Endemic Nepropathy, BEN). Obě onemocnění jsou doprovázena malignacemi v urotheliální tkáni, které jsou vyvolány karcinogenním působením AA. Zvláštním znakem AAN a BEN je skutečnost, že ne všichni pacienti vystavení působení AA byli postiženi nefropatií a vývojem nádorového onemocnění. Jednou z příčin této skutečnosti mohou být rozdíly v aktivitách a expresních hladinách enzymů biotransformujících AAI, hlavní toxickou složku obsaženou v rostlinném extraktu. Detailní poznání enzymů podílejících se na metabolismu AAI může přispět k objasnění interindividuální vnímavosti vůči AAN, BEN a malignacím. Aristolochová kyselina I je v organismu buď oxidačně detoxifikována anebo redukčně aktivována. Redukční bioaktivace AAI vede ke tvorbě kovalentních aduktů AA s DNA, které resultují ve vznik unikátní transversní mutace...
|
|
|
Mechanismus působení protinádorového léčiva ellipticinu v cílových tkáních jeho účinku
Vranová, Iveta ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Ellipticin je alkaloid čeledě Apocynaceae, který vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Na metabolismu ellipticinu se podílí cytochromy P450 (CYP) a peroxidasy za vzniku aktivačních a detoxifikačních metabolitů. Již v dřívějších pracích byly identifikovány jednotlivé isoformy CYP, které se podílí na oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce, ledviny) laboratorního potkana, vhodného modelu ilustrujícího osud ellipticinu v lidském organismu. V této diplomové práce byl studován vliv ellipticinu na obsah a aktivitu cytochromů P450 a na dalších složek MFO systému v tomto zvířecím modelu. Pro stanovení obsahu CYP a dalších složek MFO systému v isolovaných mikrosomech byly využity spektroskopické a elektrochemické metody. Pro stanovení katalytické aktivity CYP a NADPH:cytochrom P450 reduktasy byly využity reakce se specifickými substráty. Z výsledků vyplývá, že u zvířat premedikovaných ellipticinem dochází k zvýšení exprese i katalytické aktivity CYP podrodiny 1A ve všech testovaných orgánech (játra, ledviny, plíce). V játrech navíc dochází vlivem ellipticinu ke zvýšení exprese cytochromu b5 a zvýšení exprese a katalytické aktivity CYP3A. Podobně se i obsah a katalytická aktivita NADPH:cytochrom P450 reduktasy měnila v závislosti na premedikaci zvířat ellipticinem. Cytochrom P450 2S1...
|
|
|
Izolace a charakterizace mikrosomální frakce houby Pleurotus ostreatus a její úloha v degradaci 17α-ethinylestradiolu
Valášková, Petra ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Syntetický hormon 17α-ethinylestradiol (EE2), který je součástí hormonálních antikoncepčních pilulek, byl identifikován jako hlavní složka tzv. endokrinně disruptivních látek (EDc). EDc jsou látky, které napodobují svým účinkem přirozené hormony. V posledních letech se jejich množství zejména v podzemních a povrchových vodách značně zvyšuje, což má negativní vliv na hormonální systém zejména vodních organismů. Jelikož není snadné tyto látky z životního prostředí běžnými technikami odstranit, hledají se možnosti jejich biodegradace. Slibné biodegradační schopnosti vůči mnoha polutantům vykazují houby bílé hniloby, které v přírodě rozkládají lignin. Tyto houby disponují širokou škálou nespecifických extracelulárních a intracelulárních enzymů, které ve zmíněných degradacích hrají významnou roli. Tato bakalářská práce byla zaměřena na studium zástupce hub bílé hniloby, houbu Pleurotus ostreatus, a zejména degradační potenciál jeho intracelulárních enzymů při biodegradaci EE2. Nejprve byla ověřena schopnost houby Pleurotus ostreatus degradovat EE2 in vivo. Během 48 hodinové inkubace došlo k odbourání až 95,5 % EE2. Role cytochromů P450 (CYP) při metabolismu EE2 však tímto experimentem nebyla potvrzena, jelikož inhibitor CYP 1-aminobenzotriazol (1-ABT) nesnižoval účinnost degradace. V další fázi...
|
|
|
Studium interakce cytochromů P450 s potravními karcinogeny
Brabencová, Eliška ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Burdová, Kamila (oponent)
Během života na nás působí různé karcinogenní látky. Jedním z hlavních zdrojů těchto látek je potrava, která hraje významnou roli v procesu vzniku nádorových onemocnění. V této práci jsou popsány karcinogeny vznikající při technologickém zpracování potravin či při jejich tepelné úpravě - polycyklické aromatické uhlovodíky, heterocyklické aminy a nitrosaminy, dále karcinogeny produkované plísněmi - mykotoxiny a karcinogeny produkované rostlinami - safrol, estragol a pyrrolizidinové alkaloidy. Na metabolismu karcinogenů se podílí řada enzymů, mezi nejdůležitější patří cytochromy P450. Tyto enzymy představují velkou rodinu hemthiolátových proteinů, které se významně podílí na metabolismu mnoha cizorodých látek (např. karcinogenů, léčiv, polutantů). Cytochromy P450 katalyzují reakce, které vedou především k detoxikaci látek. Vedle těchto detoxikačních reakcí může však docházet k metabolické aktivaci xenobiotik na látky s vyšší toxicitou. Cytochromy P450 se významně podílí na aktivaci karcinogenů na reaktivní elektrofilní látky, které mohou poškozovat DNA. Mechanismy metabolické aktivace uvedených karcinogenů jsou předmětem této práce. Klíčová slova: cytochromy P450, karcinogeneze, potravní karcinogeny
|
|
|
Aktivita cytochromů P450 1A1, 1A2 a 3A4 exprimovaných v eukaryotních a prokaryotních systémech
Indra, Radek ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Mizerovská, Jana (oponent)
Cytochromy P450 (CYP) tvoří superrodinu hemových proteinů, jenž je široce rozšířená v přírodě. Jsou důležité pro metabolismus širokého spektra substrátů a katalyzují řadu chemických reakcí. Hrají centrální roli v metabolismu chemoterapeutik (léčiv). Mají také schopnost aktivovat některé protinádorové činidla. Ellipticin, alkaloid nalezený v rostlinách čeledi Apocynaceae, je příkladem takového substrátu cytochromů P450. V práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotickém a prokaryotickém expresním systému, jmenovitě v SupersomechTM , což jsou mikrosomy izolované z hmyzích buněk transfekovaných baculovirem nesoucím cDNA lidských CYP1A1, 1A2 a 3A4 s NADPH:cytochrom P450 reduktasou nebo v Bactosomech, které jsou membránovou frakcí buněk E. coli transfekovaných cDNA stejných lidských cytochromů a NADPH:cytochrome P450 reduktasou, pro oxidaci jejich markerových substrátů a ellipticinu. Cytochrom b5, fakultativní složka systému oxidas se smíšenou funkcí, která metabolizuje xenobiotika, byl také exprimován v některých systémech. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské CYP1A1, 1A2 nebo 3A4 exprimované v prokaryotickém nebo eukaryotickém systému oxidují své markerové substráty (EROD pro CYP1A1/2, MROD pro CYP1A2 a 6β-hydroxylaci testosteronu pro...
|
|
|
Farmaka ve vodním prostředí a jejich vliv na ryby
BURKINA, Viktoriia
Tato práce se zabývá in vivo a in vitro studiem vlivu atenololu, verapamilu, dexamethasonu, clotrimazolu a PBSA na fyziologický stav a zdraví pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss). Subchronický test zahrnující environmentálně relevantní koncentrace atenololu prokázal, že vyšší riziko vzniku oxidativního stresu je pouze u ryb vystavených působení atenololu v koncentraci minimálně 1000 ?g L-1. Druhým studovaným léčivem byl verapamil, blokátor kalciových kanálů typu L. Přes relativně vysoké koncentrace verapamilu zahrnuté do experimentu, nebyla u exponovaných pstruhů duhových zjištěna změna úrovně žádné ze sedmi jaterních reakcí zprostředkovaných enzymatickým systémem CYP450 (EROD , MROD , PROD, BFCOD , COH a PNPH). Tyto výsledky naznačují, že aktivita vybraných CYP450 nebyla verapamilem ovlivněna. Vliv PBSA ze skupiny UV filtrů byl na rybách testován v sub-chronickém testu. Expozice nejvyšší koncentraci PBSA (1000 ?g L-1) vedla k významné inhibici aktivity glutathionreduktasy (GR). Aktivita EROD, MROD, PROD se zvyšovala v závislosti na koncentraci PBSA postupně od environmentálně relevantních koncentrací. Snížená aktivita GR naznačuje, že dlouhodobé působení PBSA může u ryb zvýšit oxidativní stres. Na základě zjištění zvýšené aktivity CYP1A (EROD a MROD) a CYP2B (PROD) je možné předpokládat interakce PBSA s intracelulárními receptory. U pstruha duhového byla zjištěna po vystavení clotrimazolu řada fyziologických poruch. Změny hematologických parametrů exponovaných ryb naznačují, že u pstruha duhového došlo k ovlivnění imunitního systému a poruchám syntézy hemoglobinu. Antioxidační obranné enzymy také reagovaly na expozici clotrimazolu, a tím ovlivnily oxidativní stav exponovaných ryb. Nezměněná úroveň TBARS ve všech studovaných tkáních ryb sub-chronicky exponovaných clotrimazolu nepotvrdila oxidativní poškození lipidů. U ryb exponovaných 42 dnů clotrimazolu byla zjištěna aktivace jaterních energetických drah. Vysoká aktivita glutathion-S-transferasy byla zjištěna v játrech a žábrách, tedy v orgánech pravděpodobně spojených s detoxikačními procesy clotrimazolu. Na základě zjištěných změn v katalytické aktivitě CYP1A1 a CYP3A lze očekávat interakce clotrimazolu s intracelulárními receptory. Úroveň biokoncentračního faktoru (BCF) ve svalové tkáni naznačuje mírný bioakumulační potenciál clotrimazolu. Relativně vysoký poločas rozpadu clotrimazolu v rybích ledvinách, téměř 29 dnů, představuje větší potenciál pro nepříznivé působení na tento orgán. Toto zjištění je důležité s ohledem na strukturální změny zjištěné histologickým vyšetřením ledvin a varlat. Změny pozorované v ledvinách byly nejvýraznější u tubulárních epitelových buněk. Histologické změny gonád byly viditelné pouze u samců, přičemž patologické změny varlat mohou způsobit narušení steroidogeneze. Potenciál clotrimazolu a dexamethasonu inhibovat činnost enzymatické skupiny CYP450 v jaterních mikrozomech byl u pstruha duhového zkoumán také pomocí in vitro experimentu. Clotrimazol způsobil v jaterních mikrozomech pstruha duhového nekompetitivní inhibici aktivity EROD. BFCOD aktivita byla clotrimazolem inhibována kompetitivně. PNPH aktivita byla za přítomnosti clotrimazolu snížena jen mírně, což naznačuje fyziologicky nevýznamnou interakci clotrimazolu s CYP2E1. Přítomnost dexamethasonu neovlivnila žádné studované enzymy CYP450. V souhrnu výsledky této studie potvrdily, že přítomnost clotrimazolu v životním prostředí je znepokojující, pokud jde o jeho dopad na zdravotní stav ryb. Tato práce shrnuje aktuální údaje o účincích některých PPCP na ryby. Studovaná kardiovaskulární a protizánětlivá léčiva nepředstavují na základě odezvy vybraných molekulárních markerů významné riziko pro ryby, zatímco testované fungicidní léčivo a UV filtr mohou u ryb narušit řadu fyziologických procesů.
|
host ::
RSS.