|
|
Příprava a studium lidského NK buněčného receptoru AICL
Nový, Jiří ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Přirozené zabíječské buňky neboli NK buňky jsou nedílnou součástí přirozené imunity a plní funkci rozpoznání a usmrcení nádorových a virem infikovaných buněk. Jejich funkce je regulována signály produkovanými díky interakci inhibičních a stimulačních receptorů na svém povrchu se svými specifickými ligandy na povrchu cílové buňky. Aktivačním receptorem je také NK receptor NKp80, který tvoří velmi specifický komplex s buněčným receptorem AICL, přičemž oba tyto receptory spadají do rodiny receptorů podobným lektinům C-typu. Zvýšená exprese receptoru AICL je přednostně specifická pro nádorové buňky myeloidního charakteru. Tato diplomová práce popisuje produkci mutované formy AICL expresí v bakteriích Escherichia coli BL21 Gold (DE3) a následnou izolaci a in vitro renaturaci cílového proteinu. V předchozí studii bylo zjištěno, že lichý počet cysteinů v extracelulární lektinové doméně AICL způsobuje špatné sbalení proteinu. Záměnou lichého cysteinu za serin v poloze 87 bylo dosaženo zisku stabilní rozpustné formy AICL se sudým počtem cysteinů v konzervovaných pozicích, charakteristickým pro receptory C-lektinového typu. Správnost tvorby disulfidových můstků mezi cysteiny byla ověřena hmotnostní spektrometrií. Zisk značného množství proteinu umožnil nasazení krystalizačních pokusů v širokém spektru...
|
|
|
Lectin receptor-ligand interaction important in experimental tumor therapy
Grobárová, Valéria ; Černý, Jan (vedoucí práce) ; Filipp, Dominik (oponent) ; Krulová, Magdaléna (oponent)
Lektin-sacharidové interakce jsou zapojeny do mnoha biologických procesů, které jsou nezbytné pro přežití a správnou funkci mnohobuněčných organismů. Receptory podobné lektinům C-typu, které se nacházejí převážně na povrchu buněk vrozeného imunitního systému, rozpoznávají sacharidové struktury na mikrobech a také glykosylační vzorec na nádorových buňkách. Rodina receptorů NKR-P1 byla mezi prvními identifikovanými rodinami receptorů NK (natural killer-"přirozený zabíječ") buněk, nicméně ligandy pro některé členy zůstávají stále neznámé. V nedávné době byly po prošetření Etickou komisí Mikrobiologického ústavu AVČR v. v. i. a Univerzity Karlovy v Praze některé publikace popisující oligo- sacharidové struktury zakončené N-acetylglukosaminem jako možné ligandy pro NKR-P1 receptor doporučeny ke korekci/retrahování. Přezkoumání účinku glykodendrimerů, zejména vliv osmivětevných dendrimerů s N- acetyl-D-glukosaminem na polyamidoaminové kostře (GN8P), ukázalo většinou nepřímou roli NK buněk na modulaci imunitní odpovědi. Správně složené rozpustné rekombinantní potkaní NKR-P1A a myší NKR-P1C receptory nevážou neoglykoproteiny modifikované GlcNAc strukturami. Kromě toho byly pro vazbu sacharidů zjištěny nové cílové populace buněk (NKT buňky a makrofágy).
|
|
|
Studies on structure and biological functions of NKR-P1 receptors
Rozbeský, Daniel ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Drbal, Karel (oponent)
Významnou součástí imunitního systému jsou NK buňky, které jsou schopny rozpoznávat a zabíjet některé nádorové a virem infikované buňky. Rozpoznávání abnormálních buněk je zprostředkováno sofistikovaným repertoárem aktivačních a inhibičních receptorů, které se nachází na povrchu NK buněk. Mezi nejznámější receptory patří rodina C-lektinových receptorů NKR-P1, o kterých se předpokládá, že jsou transmembránové proteiny II. typu vyskytující se na membráně v podobě disulfidicky vázaných homodimerů. Ačkoliv od jejich objevu uplynulo více než 20 let, jejich struktura a funkce je stále zahalená rouškou tajemství. Cílem disertační práce byl strukturní výzkum myších NKR-P1 receptorů za účelem poznat jejich funkce. V první části jsme vyvinuli metodu pro přípravu rekombinantních receptorů myší rodiny NKR-P1. Dále jsme se detailně zabývali receptorem NKR-P1A, jehož struktura byla vyřešena pomocí rentgenové strukturní analýzy s rozlišením 1,7 A. Unikátní vlastností struktury byla smyčka extendovaná z konzervované C-lektinové domény, která v krystalu interagovala se symetricky sdruženou molekulou. Konformace a flexibilita smyčky byla dále studována v roztoku pomocí vodík/deuteriové výměny a chemického síťování ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Jednotlivé analýzy potvrdily, že struktura NKR-P1A se v roztoku liší od...
|
|
|
NK cells and their receptors in immune regulation - possible targets for immunomodulation
Svoboda, Jan ; Fišerová, Anna (vedoucí práce) ; Pěknicová, Jana (oponent) ; Kročová, Zuzana (oponent)
(česky) Přirození zabíječi - buňky NK hrají důležitou roli v imunitním dohledu a regulaci jednak přímým cytotoxickým působením na infikované, transformované či jinak poškozené buňky, ale také produkcí cytokínů a chemokínů. Výsledná odpověď je dána převahou stimulačních nebo inhibičních signálů, přenášených širokou paletou membránových receptorů. Zabíječské s Ig- příbuzné molekuly KIR2DL4 a LILRB1, které rozpoznávají vlastní HLA-G molekuly během těhotenství stejně jako NKR-P1 receptory lišící se ve funkci a počtu izotypů jsou druhově závislé a redukované v průběhu fylogeneze, zatímco NKG2D, reagující na stresem indukované proteiny a adenozínové receptory (AR) potlačující zánětovou reakci, zůstávají evolučně konzervované. Cílem této práce bylo studium zapojení NK buněk a jejich receptorů v několika modelech imunitních poruch a u různých savčích druhů, za účelem získání nového náhledu na jejich funkci a možnost imunitní modulace. Ukázali jsme zde, že výběr druhu ve studiu ovlivnění NK buněčné funkce může být v některých případech kritický. Reakce na glykany, s využitím syntetického GlcNAc terminovaného glykomimetika GN8P, měla protichůdné účinky na NK buněčnou funkci u lidí a C57Bl/6 myší. U lidí byla snížena cytotoxická aktivita NK buněk s vysokou expresí NKR-P1A, zatímco u myší podání GN8P aktivalo...
|
|
|
Úloha vrozené a získané imunity v imunoterapii melanomu a pankreatického adenokarcinomu
NEDBALOVÁ, Pavla
Tato práce se zabývá úlohou vrozené a získané imunity v imunoterapii založené na kombinaci ligandů stimulujících fagocytózu, kotvených do membrány nádorových buněk, a směsi TLR agonistů. Tato terapie je cílená na aktivaci vrozené imunity a vede k mohutné intratumorální zánětlivé infiltraci jejíž součástí jsou např. neutrofily a NK buňky. Dalším úkolem této práce bylo vyhodnotit cytotoxické působení neutrofilů a NK buněk na nádorové buňky. Pro práci byly použity modely maligního melanomu a pankretického adenokarcinomu.
|
|
|
Příprava rekombinantních forem extracelulární domény myších leukocytárních receptorů z rodiny NKR-P1.
Adámek, David
Myší receptory NK buněk patřící do rodiny NKR-P1 hrají roli v regulaci odpovědi těchto buněk z hlediska jejich aktivace, inhibice a produkce cytokinů. Tato diplomová práce se zabývá přípravou extracelulárních částí aktivačních receptorů mNKR-P1A a mNKR-P1C z myšího kmene C57BL/6. Cílem bylo připravit produkční vektor obsahující kódující sekvenci příslušných částí obou receptorů, optimalizovat jejich produkci v bakteriích E. coli a nalézt vhodný postup jejich renaturace a purifikace in vitro. Čisté proteinové preparáty byly následně ověřeny a analyzovány hmotnostní spektrometrií a rovněž značeny fluorescenční značkou za účelem hledání ligandu na buněčných preparátech. V budoucím výzkumu bude řešena struktura připravených proteinových preparátů a rovněž budou použity k hledání svých ligandů. Dané poznatky mohou v budoucnu dopomoci k lepšímu pochopení NK buněk.
|
|
|
Příprava rekombinantních forem extracelulární domény myších leukocytárních receptorů z rodiny NKR-P1.
Adámek, David ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent)
Myší receptory NK buněk patřící do rodiny NKR-P1 hrají roli v regulaci odpovědi těchto buněk z hlediska jejich aktivace, inhibice a produkce cytokinů. Tato diplomová práce se zabývá přípravou extracelulárních částí aktivačních receptorů mNKR-P1A a mNKR-P1C z myšího kmene C57BL/6. Cílem bylo připravit produkční vektor obsahující kódující sekvenci příslušných částí obou receptorů, optimalizovat jejich produkci v bakteriích E. coli a nalézt vhodný postup jejich renaturace a purifikace in vitro. Čisté proteinové preparáty byly následně ověřeny a analyzovány hmotnostní spektrometrií a rovněž značeny fluorescenční značkou za účelem hledání ligandu na buněčných preparátech. V budoucím výzkumu bude řešena struktura připravených proteinových preparátů a rovněž budou použity k hledání svých ligandů. Dané poznatky mohou v budoucnu dopomoci k lepšímu pochopení NK buněk.
|
|
|
Potenciace biologické aktivity IL-2 a IL-15 in vivo.
Votavová, Petra ; Kovář, Marek (vedoucí práce) ; Reiniš, Milan (oponent)
4 Abstrakt Díky své významné schopnosti stimulovat aktivované T lymfocyty a NK buňky je interleukin-2 již dlouhou dobu atraktivní molekulou pro imunoterapii. Avšak jeho velkým nedostatkem jsou nepříznivé farmakologické vlastnosti, mezi něž patří velmi krátký biologický poločas a závažná toxicita spojená s vysokými léčebnými dávkami. Pro mnoho imunoterapeutických využití je dále limitující role IL-2 coby esenciálního růstového faktoru pro T regulační buňky. Doposud bylo studováno několik přístupů, jak u IL-2 dosáhnout lepšího terapeutického potenciálu. Nejvýznamnějším z nich jsou pravděpodobně nedávno popsané IL-2/anti-IL-2 mAb imunokomplexy, které vykazují o mnoho vyšší a selektivní biologickou aktivitu oproti volnému IL-2 in vivo. V této diplomové práci jsme se snažili ukázat a zdůraznit výhody IL-2/anti-IL-2 mAb imunokomplexů nad volným IL-2 tím, že jsme porovnali jejich biologickou aktivitu. Dále jsme na dvou syngenních myších nádorových modelech (EL4 T lymfomu a B16F10 melanomu) prokázali, že mají IL-2/anti-IL-2 mAb imunokomplexy nespornou protinádorovou aktivitu. Tím jsme zdůvodnili potenciální využití IL-2/anti-IL-2 mAb imunokomplexů v nádorové imunoterapii. My sami jsme také uplatnili jeden ze způsobů, jak zvýšit stabilitu a poločas IL-2 in vivo. Proto jsme IL-2 kovalentně konjugovali k syntetickému...
|
|
|
Příprava rekombinatních extracelulárních domén leukocytárních receptorů AICL a NKR-P1CBALB
Čonka, Martin ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Cebecauer, Marek (oponent)
v českém jazyce NK buňky jsou řazeny mezi populaci lymfocytů, která je schopna cytotoxicky usmrtit některé nádorové či viry infikované buňky. Předmětem této diplomové práce je myší NK buněčný receptor mNKR-P1CBALB a lidský leukocytární receptor hAICL. mNKR-P1CBALB je řazen mezi aktivační receptory a je schopen aktivovat cytotoxické funkce NK buněk vůči cílovým buňkám. Receptor hAICL je ligandem lidského aktivačního NK buněčného receptoru NKp80. Interakce mezi těmito proteiny též vede k aktivaci efektorových funkcí NK buněk. Cílem této práce bylo připravit rekombinantní extracelulární části receptorů mNKR-P1CBALB a hAICL, optimalizovat jejich in vitro renaturaci a charakterizovat tyto proteiny pomocí hmotnostní spektrometrie. Takto získané proteinové preparáty poslouží k dalšímu studiu struktury extracelulárních částí těchto leukocytárních receptorů.
|
|
|
Proteomická charakterizace membránových mikrodomén lidských NK buněk
Kádek, Alan ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Proteomická charakterizace membránových mikrodomén lidských NK buněk. Bc. Alan Kádek (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Česká republika) Přirozené zabíječské (NK) buňky jsou důležitou součástí neadaptivního imunitního systému. Uplatňují se zejména v boji proti nádorovým, virově infikovaným či jinak malformovaným buňkám. Plasmatická membrána NK buněk obsahuje oblasti se specifickým lipidovým složením v porovnání s okolní membránou (tzv. membránové mikrodomény či rafty). Mikrodomény jsou díky odlišné lipidové stavbě místem preferenčního výskytu některých imunologicky zajímavých proteinů a hrají roli v procesech buněčné polarizace a signalizace. Charakteristickou vlastností membránových mikrodomén je částečná rezistence vůči solubilizaci mírnými neionogenními detergenty. V této práci byly v rámci detergentu-rezistentní membránové frakce (DRM) izolovány mikrodomény z lidské buněčné linie NK-92MI a z NK buněk získaných imunomagnetickou separací z periferní krve neleukemických dárců. K izolaci byly využity detergenty Triton X-100 nebo Brij-98 a ultracentrifugace v sacharosovém gradientu. Proteinové složení izolovaných DRM bylo analyzováno hmotnostní spektrometrií metodou LC-MALDI- TOF/TOF. Seznamy identifikovaných proteinů z těchto analýz vykazují některé zajímavé...
|
host ::
RSS.