|
|
Membrane microdomains in regulation of lipid metabolism
Veselá, Petra ; Malínský, Jan (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Zimmermannová, Olga (oponent)
Model fluidní mozaiky popsaný Singerem a Nicolsonem v roce 1972 byl nadčasový, a i po více než 50 letech zůstává relevantní pro pochopení struktury, funkce a dynamiky biologických membrán. Jeho autoři od samého začátku připouštěli existenci laterálních oblastí membrány, které se svým složením a biologickou funkcí liší od bezprostředního okolí, proto ani soudobé studie prokazující existenci mnoha různých membránových mikrodomén nepředstavují pro platnost tohoto modelu zásadní výzvu. Výzkum zejména v posledních dvaceti letech prokázal, že celá řada buněčných procesů (transport živin, signalizace, regulace metabolismu nukleových kyselin, lipofágie a mnoho dalších) je vázána na membránové mikrodomény. Molekulární detaily těchto vazeb však v mnohých případech zůstávají skryty. Cílem této práce je nalézt konkrétní spojitost mezi membránovými mikrodoménami a metabolismem vybraných lipidů. Na modelu kvasinky S. cerevisiae dokumentujeme napojení specializované mikrodomény plasmatické membrány, membránového kompartmentu argininové permeázy Can1 (MCC), na metabolismus sfingolipidů a mitochondriálních anionických fosfolipidů, fosfatidylglycerolu (PG) a kardiolipinu (CL). Úvodní dvě kapitoly se zabývají objasněním úlohy transmembránového proteinu Nce102 v regulaci biosyntézy sfingolipidů. Ukázali jsme, že v...
|
|
|
Bioorthogonal labelling of surface receptors on living lymphocytes
Paldusová, Kateřina ; Cebecauer, Marek (vedoucí práce) ; Benda, Aleš (oponent)
Buněčný povrch vykazuje vysokou heterogenitu na chemické I geometrické úrovni. Abychom porozuměli funkci buněk, musíme věnovat pozornost morfologickým znakům vytvořeným na plazmatické membráně. Pro studium buněčného povrchu s molekulární specifitou existuje spousta zobrazovacích metod, počínaje konvenční wide-field mikroskopií, přes konfokální mikroskopii, konče super-rezoluční fluorescenční mikroskopií a elektronovou mikroskopií. Studie využívající super-rezoluční mikroskopii prováděné na fixovaných buňkách poskytují podrobná steady-state data o nanoskopické organizaci buněčného povrchu a distribuci molekul v rámci morfologických struktur. Protože jsou však buňky součástí živých organismů a neustále mění své vlastnosti v čase a prostoru, informace o dynamice buněčných struktur a pohyblivosti molekul zůstávají při použití tohoto přístupu skryty. Ke studiu dynamických změn na úrovni jedné molekuly jsou nutné metody kompatibilní s životaschopností buněk. V této studii se zaměřujeme na distribuci a dynamiku molekul CD2 a CD4 exprimovaných na povrchu nestimulovaných T buněk. Hlavním cílem této práce bylo vyvinout novou metodu pro zobrazování živých buněk a sledování jednotlivých molekul membránově-vázaných protein ve 3D a s nanometrovou přesností. Pomocí takového nástroje lze zkoumat dynamiku...
|
|
|
Spojování světla dvou zdrojů v integrační sféře
Mellová, Katarína ; Šicner, Michal (oponent) ; Dostál, Zbyněk (vedoucí práce)
Novo vyvíjaná generácia koherenciou riadeného holografického mikroskopu bude vybavená fluorescenčným modulom. Práca pojednáva o základných princípoch a aplikácii fluorescenčnej mikroskopie vrátane popisu holografického mikroskopu. Je vykonaná a vyhodnotená rešerš dostupných svetelných zdrojov používaných vo fluorescenčnej mikroskopii. Navrhnutý zdroj spája žiarenie o vybraných excitačných vlnových dĺžkach pomocou integračnej sféry, ktorá má navyše aj homogenizačný efekt. Touto inovatívnou konštrukciou je zabezpečená rýchla a efektívna zmena excitačných vlnových dĺžok, vzhľadom na použitý fluorofór a tiež možnosť priameho pripojenia zdroja k mikroskopu. Pre výber vhodného usporiadania zdroja sú navrhnuté tri ideové návrhy jeho fungovania. Vybrané návrhy boli overené simuláciou a boli vybrané vhodné optické komponenty. Výsledná konštrukcia je otestovaná.
|
|
|
Diference emitovaného záření ve fluorescenční superrozlišovací mikroskopii
Havelka, Tomáš ; Kollárová, Věra (oponent) ; Bouchal, Petr (vedoucí práce)
Fluorescenční mikroskopie nachází široké uplatnění v biologických vědách ale i v technickém výzkumu. Díky úplné prostorové nekoherenci záření emitovaného ze vzorku je fluorescenční mikroskopie základem řady superrozlišovacích metod. Bakalářská práce je zaměřena na metodu diference emitovaného záření. Tato metoda k dosažení superrozlišení využívá rozdílu standardního a vírového obrazu. K vytvoření vírového obrazu se v této práci využívá q-destičky. Q-destička je prvek z kapalných krystalů a umožňuje nahradit finančně nákladné prostorové modulátory světla využívané v předešlých implementacích metody. Metoda diference emitovaného záření je v bakalářské práci popsána teoretickým výpočtem a numerickým modelem na úrovni bodového a plošného zobrazení. V rámci experimentální části práce byla připravena optická sestava umožňující praktické testování zkoumané metody. Hlavním výsledkem práce je originální implementace metody diference emitovaného záření pomocí q-destičky a ověření možnosti dosáhnout superrozlišení při zobrazení florescenčních nanočástic.
|
|
|
Kalibrace fluorescenčního optického mikroskopu s pomocí elektronového obrazu
Erlich, Lukáš ; Polášek, Tomáš (oponent) ; Čadík, Martin (vedoucí práce)
This master’s thesis deals with the topic of image correction in fluorescence optical microscopy using electron image as a template. The aim is to design methods to analyze observed distortions in investigated microscopic systems and propose techniques for their correction. The thesis also presents a calibration sample that is utilized within it. Additionally, the work provides an overview of some existing solutions for modeling and suppressing distortion.
|
|
|
Fluorescenční spektroskopie ve výzkumu organizace biologických membrán
Vítek, Ondřej ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá srovnáním a optimalizací metod studia biologických membrán pomocí fluorescenční spektroskopie a mikroskopie s využitím bakterie Cupriavidus necator H16 (obsahující PHB granule) a PHB-4 (neobsahující PHB granule) jako modelového organismu. Experimentálně byla určena vhodná koncentrace sondy laurdan pro barvení biologických membrán a čas potřebný k jejímu průniku do buňky. Takto obarvené organismy byly dále studovány pomocí steady-state spektrofluorimetrie, při které byl zkoumán vliv teploty na tvar emisního spektra a také možnost promývání jako jednoho z kroků při přípravě vzorků. Obě tato měření naznačují výhodnost promývání, ale neposkytují nezpochybnitelné výsledky. Rozdíl mezi dvěma kmeny bakterie byl ale pozorován. Dále byly bakterie podrobeny fluorescenční mikroskopii. Tato metoda se projevila jako potenciálně užitečná pro studium výraznějších variací ve stupni uspořádání membrán buněčné membrány a pro zobrazování dalších větších útvarů. Distribuce laurdanu v rámci Cupriavidu necator H16 působí nerovnoměrněji ve srovnání s PHB-4. Získané poznatky tak naznačují vliv přítomnosti granulí při barvení fluorescenčními sondami, nelze je ale interpretovat jednoznačně.
|
|
|
Molecular mechanisms of the assembly and function of BBSome
Prasai, Avishek ; Huranová, Martina (vedoucí práce) ; Varga, Vladimír (oponent) ; Bosáková, Michaela (oponent)
Bardetův Biedlův syndrom (BBS) je genetická porucha způsobená dysfunkcí BBSomu, což je oktamerický adaptorový proteinový komplex. BBSome transportuje signální receptory dovnitř a ven z cílií, což jsou senzorické buněčné organely vystavěné na V první části práce jsme se zaměřili na objasnění formování BBSomu v živých buňkách. Vytvořili jsme knihovnu lidských a myších buněčných linií, kterým chyběly jednotlivé podjednotky BBSomu a vnesli jsme do nich ostatní podjednotky označené YFP proteinem. K analýze jednotlivých kroků formování BBSomu jsme použili biochemické testy, imunofluorescenci a kvantitativní fluorescenční mikroskopii. Odhalili jsme, že sestavování BBSomu probíhá postupně v různých částech buňky. Ukázali jsme, že BBS4 iniciuje rních satelitech. Přemístění pre bázi a finální zkompletování BBSomu umožňuje BBS1. Odhalili jsme také, že v buňkách, kde chybí BBS12 chaperonin, se formuje malá část BBSomu a/nebo subkomplexů . To naznačuje, že BBS chaperoniny zajištují Ciliární ektocytóza odstraňuje přebytečné ciliární signální receptory prostřednictvím odštěpení apikální části ciliární membrány, což je regulované polymerizací aktinu. Faktory které spouštějí polymerizaci aktinu v místě ektocytózy, zůstávají neznámé. Ve druhé části práce jsme odhalili, že CDC42, člen rodiny RHO GTPáz, spouští polymerizaci...
|
|
|
Utilisation of fluorescence techniques for analysis of industrially relevant microorganisms
Müllerová, Lucie ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Krčma, František (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Single-cell analysis techniques are very important when studying relevant biotechnological microorganisms. In biotechnological processes, the optimum is to have fast, efficient and real-time analyses that can be done with minimal preparations. Therefore, we looked at autofluorescence as a possible and natural marker when employing fluorescence microscopy and flow cytometry. First, it has been established, based on the emission spectra, that the green autofluorescence of the bacteria used – Cupriavidus necator H16 and its non polyhydroxyalkanoates (PHA) producing mutant Cupriavidus necator PHB-4, is caused predominantly by flavins. The maxima of emission spectra were 510 – 550 nm for FAD, FMN and riboflavin whose spectra could not be distinguished, and 515 nm for both strains of Cupriavidus necator. Two maxima of excitation spectra of the bacteria were found – one in the range 360 – 370 nm and another around 440 nm, and so a new protocol for fluorescence microscopy has been established - the laser used was 467 nm and the emission filter chosen for the detection was 520/35 nm. Flavins and their autofluorescence can also be used in combination with other fluorophores when the need for multi-parametrical analyses arises, but it’s highly recommended the other dyes emit other than green fluorescence in the band of 500 – 550 nm or/and have an average fluorescence lifetime other than 3.2 – 3.7 and 4.2 - 4.9 ns. These values stayed constant even when the cells were exposed to various cultivation and even stress conditions. That makes them a very stable marker compared to the dynamic marker of fluorescence intensity that changes immediately after a change in the environment. A new staining protocol for C. necator using PHA-specific hydrophobic probe BODIPY 493/503 was optimised. The optimal staining concentration of the lipophilic dye BODIPY 493/503 was determined to be 2.5 µg ml-1 and it can be used in combination with propidium iodide. The BODIPY 493/503 staining protocol has been used when analysing the morphology of the PHA-synthesising bacteria Halomonas halophila. Further, to study the UV-protective properties of PHA in Cupriavidus necator, another staining essay has been optimised. It has been established that the ROS sensitive dye CM-H2DCFDA gives better performance than its non-methylated form. Also, the UV-protective characteristics of the PHA-synthesising strain Cupriavidus necator H16 were confirmed when compared to its non-PHA synthesising strain C. necator PHB-4.
|
|
|
Tracking membrane permeabilization on single lipid vesicles - method development.
Gücklhorn, David ; Šachl, Radek (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent)
Proteinové komplexy se obtížně studují, obzvlášť pokud vznikají jen v membránovém prostředí a na velmi krátkou dobu. Toto je problematické například v případě fibroblastového růstového faktoru 2 (FGF2), což je protein s mnoha fyziologickými i patologickými funkcemi v lidském organismu. Hraje zásadní roli v rozvoji různých nádorových onemocnění, protože braní apoptóze buněk pomocí autokrinní signalizace a také stimuluje angiogenezi. Zároveň je v současné době zkoumána možnost jeho uplatnění v léčbě zranění periferního nervstva. Přestože je důkladně zkoumán již řadu let, mechanismus jeho translokace do mezibuněčného prostoru, kde vykonává svou funkci, nebyl zcela objasněn. Pro studium komplexních systému, jako jsou membránové póry tvořené FGF2, jsme vyvinuli jednoduchou a efektivní metodu fluorescenční mikroskopie. Tato metoda se jmenuje dvojitá permeabilizační esej jednotlivých vezikulů (DLSGA). Využívá lipidové vezikuly (GUVs) pro simulaci buněčné membrány. V jediném experimentu je možné sledovat až 300 jednotlivých vezikulů a tvorbu pórů v jejich membráně. Během třech měření za různých podmínek získáváme detailní informaci o dynamice otevírání pórů na každém vezikulu. Na základě těchto měření je možné jednotlivé vezikuly rozdělit do šesti skupin podle toho, jestli se na nich tvořili póry a jak...
|
|
|
Segmentation of phase contrast images in multi epitope ligand cartography (MELC) for image quantification at the single cell level
Mívalt, Filip ; Taschner-Mandl,, Sabine (oponent) ; Mehnen, Lars (vedoucí práce)
The Multi-Epitope Ligand Cartography (MELC) technique enables microscopy-based visualisation of multiple cellular compartments by using immunofluorescence stains. A MELC data processing pipeline as previously established in-house within an ongoing research project, providing biologists with a tool for quantitative antibody signal analysis. The pipeline, therefore, allows phenotype characterisation of cells present in bone marrow aspirates from neuroblastoma patients. The antibody signal assignment to the plasma membrane of single cells is based on nuclear segmentation and region growing, but only approximates the real cellular shape. This approach is particularly error-prone when applied on touching or overlapping cells due to an ambiguous assignment of a single antibody signal to multiple cells. This error, subsequently, propagates to single-cell level features, thereby possibly influences ensuing phenotype classification or quantification. Hence, the segmentation of phase contrast images acquired simultaneously with each fluorescence image and visualising the whole cell (including cytoplasm and nucleus), is required to provide the pipeline with accurate segmentation masks representing the entire cell. We implemented an automated strategy employing a Mask R-CNN network to segment these phase contrast images. The algorithm achieved an overall object-level F1 score of 0.935 and a pixel-level F1 score of 0.868 when training with only a small annotated dataset. The trained model was implemented into the existing MELC data processing pipeline. Moreover, we provide an annotated dataset comprising 54 phase contrast images of bone marrow cytospin preparations containing an overall number of 1,940 cells. The implemented Mask RCNN model enables to study single cell-level features using segmentation masks representing cells predicted from phase contrast images and therefore improves an automated quantitative analysis of bone marrow samples for children’s cancer research.
|
host ::
RSS.