|
|
Úloha SIRT1 během zrání oocytů v podmínkách in vitro
Landsmann, Lukáš ; Nevoral, Jan (vedoucí práce) ; Šolc, Petr (oponent)
SIRT1 je histon deacetyláza působící na své epigenetické i ne-epigenetické cíle. Předpokládáme, že SIRT1 je zapojen do procesu zrání oocytů a to především v ooplazmě oocytu, která ovlivňuje další osud zralého oocytu a vzniklého embrya. Naší hypotézou je, že ve zralém oocytu působí SIRT1 jako signální molekula přes specifickou epigenetickou a ne-epigenetickou regulaci. Pozorovali jsme re-lokalizaci SIRT1 ve zralém oocytu a následně jeho spojitost s mikrotubuly vřeténka. Ve zralém oocytu SIRT1 vytváří vřeténku podobný vzor. Tato specifická vazba SIRT1 na vřeténko podporuje snížení acetylace α-tubulinu. Na základě pozorování histonového kódu v nezralých a zralých oocytech jsme potvrdili, že SIRT1 je převážně předurčen pro epigenetické působení v zárodečném váčku (GV) nezralého oocytu. V souladu s tímto tvrzením jsme potvrdili, že SIRT1 řídí trimethylaci histonu H3 na lyzinu K9 ve zralém oocytu, kterou považujeme za dědičnou napříč meiotickým zráním. Souhrnně naše pozorování poukazuje na dvojí efekt SIRT1 v oocytech v závislosti na kontextu meiotické progrese, kdy dochází k přepínání epigenetického a ne-epigenetického působení SIRT1 během progresu meiotického zrání. Klíčová slova: oocyt, SIRT1, histon, vývojová kompetence, tubulin, epigenetika
|
|
|
Vizualizace RNA a její translace v savčím oocytu
Bašus, Kryštof ; Tětková, Anna (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent)
Translace je jeden ze základních biologických procesů. Předpokládá se, že lokalizace mRNA a její translace v určitý čas a na konkrétních místech hraje roli při mnoha buněčných pro- cesech. Savčí oocyt se po dosažení své plné velikosti stává transkripčně inaktivním a využívá pouze RNA nasyntetizované a uložené v raných fázích vývoje. Regulace syntézy proteinů na úrovni translace je tedy klíčová pro správné dokončení meiotického zrání oocytů a při časném vývoji embryí. Pro monitorování buněčné fyziologie je nutné umět vizualizovat a sledovat konkrétní molekuly a procesy na úrovni jednotlivých buněk. To je umožněno vývojem světelné mikrosko- pie a fluorescenčních sond, které se specificky váží na určité organely, buněčné struktury, pro- teiny nebo jiné molekuly. V této práci popisuji vybrané metody vizualizace RNA, globální trans- lace i translace specifických transkriptů a hotových proteinů. Metody, kterými se tato práce zabýva jsou RNA FISH, vizualizace translace pomocí analogů methioninu, FUNCAT, SUnSET, FlAsH, ReAsH, TRICK, SINAPS, FUNCAT-PLA, PURO-PLA. Klíčová slova: Translace, RNA, Protein, Vizualizace, Oocyt
|
|
|
Identification of key regulators of gene expression in mammalian oocyte and embryo
Jansová, Denisa ; Šušor, Andrej (vedoucí práce) ; Gahurová, Lenka (oponent) ; Lin, Chih-Jen Lance (oponent)
Souhrn práce Savčí oocyt je vysoce diferencovaná buňka, ze které po oplození vzniká embryo. Na konci růstové fáze se plně dorostlý oocyt stává transkripčně inaktivním. Během následujících fází vývoje oocytu, tedy během jeho zrání, oplození a následně během časného embryonálního vývoje, jsou využívány pouze transkripty nasyntetizované v růstové fázi oogeneze, které oocyt skladuje k pozdějšímu využití. Distribuce mRNA je úzce svázána s lokalizací a funkcí proteinu, který kóduje. Tohoto mechanismu regulace genové exprese využívají různé typy buněk. Zatím ovšem není mnoho známo o lokalizaci mRNA molekul a jejich translaci v savčím oocytu a časném embryu. Cílem této práce bylo detekovat celkový transkriptom a komponenty translačního aparátu v savčím oocytu a dvoubuněčném embryu a odhalit mechanismus regulující translaci, která je důležitá pro správný vývoj oocytu a embrya. Ukázali jsme, že jádro myšího i lidského oocytu obsahuje RNA molekuly a RNA vazebné proteiny. Po rozpadu jaderné membrány dochází k translaci v oblasti chromosómů. Předpokládáme, že molekuly mRNA, které jsou přítomny v jádře oocytu, jsou následně po rozpadu jaderné membrány zpřístupněny translačnímu aparátu a dochází k jejich translaci a vzniku proteinů, které jsou důležité pro správný průběh meiotického zrání oocytu a časného embryonálního...
|
|
|
Časo-prostorové utváření molekulárních gradientů v časném embryonálním vývoji Xenopus laevis.
Flachsová, Monika
Detailní pochopení vývoje nového jedince zavisí na objasnění časo- prostorových mechanismů, které určují tělní plán. Z tohoto důvodu klíčovou otázkou časného embryonálního vývoje obratlovců stále zůstává, kdy a jak dochází k determinaci a diferenciaci jednotlivých buněk, což posléze vede ke specifikaci tělní osové polarity a založení základů všech orgánů a tkání. Odpověď na tuto otázku přinese nové možnosti využití nejen pro primární výzkum, ale i pro obor aplikované medicíny. Hlavní cíl předkládané disertační práce spočíval ve stanovení časo- prostorových molekulárních gradientů buněčných determinantů v průběhu časného embryonálního vývoje. Jako modelový organismus byla zvolena africká drápkatá žába, druh Xenopus laevis, která disponuje dostatečně velkými oocyty a vnější embryogenezí. Vzhledem k pozdní aktivaci embryonálního genomu se předpokládá, že stěžejní mechanismus počáteční determinace buněk závisí na nerovnoměrné lokalizaci maternálních faktorů uvnitř oocytu a jejich asymetrické distribuci do dceřiných blastomer v průběhu rýhování. Pomocí metody qPCR tomografie byly identifikovány dva hlavní lokalizační gradienty s preferencí buď v animální, nebo vegetativní hemisféře zralého oocytu. Tyto gradienty se shodovaly jak pro maternální mRNA, tak i pro miRNA molekuly. U maternální mRNA navíc...
|
|
|
Analysis of pluripotent gene expression program in early embryos and embryonic stem cells
Moravec, Martin ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Motlík, Jan (oponent)
Pluripotence je schopnost buňky diferencovat do jakéhokoliv buněčného typu. Formuje se během časného embryonálního vývoje u savců a její vznik je spojen s reprogramací genové exprese na globální úrovni. Proces přirozeného vzniku pluripotence není stále zcela pochopen. Pro získání nového pohledu na události, které vedou ke vzniku pluripotence u savců, studovali jsme změny v genové expresi během oocyt-zygotického přechodu u myši. V tomto modelovém systému, oplodněné vajíčko podstoupí reprogramaci, která vede k vytvoření pluripotentních blastomer. Tyto blastomery zakládají samotné embryo. Cílem mé diplomové práce bylo analyzovat aktivaci transkripce během časného vývoje a vyvinout metodu pro monitorování exprese genů v oocytech, časných embryích a embryonálních kmenových buňkách. Metoda využívá kvantitativní PCR a umožnuje změřit expresi až 48 vybraných genů, které slouží jako markery pro maternální degradaci, aktivaci pluripotentního programu a diferenciaci do zárodečných linií. Dále ukazujeme, že náš systém monitoruje dynamiku transkriptomu během oocyt-zygotického přechodu, a získané výsledky jsou srovnatelné s daty naměřenými pomocí jiných metod. Díky našemu bioinformatickému přístupu jsme navíc identifikovali nové oocyt-specifické a zygotické nekódující RNA. Klíčová slova: pluripotence,...
|
|
|
Messenger RNA stability and microRNA activity in mouse oocytes
Flemr, Matyáš ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Motlík, Jan (oponent) ; Hampl, Aleš (oponent)
SOUHRN Přerod oocytu v zygotu představuje jediný fyziologický děj během životního cyklu savců, při kterém se z diferenciované buňky stává buňka pluripotentní. Toto buněčné přeprogramování je z velké většiny závislé na bezchybné post-transkripční regulaci maternálních mRNA. Porozumění mechanismům post-transkripční regulace v oocytech proto povede k významnému rozšíření našeho poznání v otázce buněčného přeprogramování. Mezi důležité post-transkripční regulátory v širokém spektru buněčných a vývojových procesů patří nedávno objevené krátké nekódující mikroRNA. Jejich funkce spočívá v represi cílených mRNA za pomoci proteinových komplexů, které spouštějí deadenylaci a odstranění ochranné čepičky z 5'-konce. Zmíněné komplexy se za normálních okolností sdružují v tzv. procesních tělískách (P-tělíska) v cytoplasmě. Tato práce přináší nečekané zjištění, že mikroRNA dráha je umlčená v plně dorostlých myších oocytech i během přerodu oocytu do zygoty. Toto zjištění je v souladu s pozorovaným rozpadem P-tělísek závislých na funkci mikroRNA během růstu oocytu a jejich absenci v plně dorostlých oocytech. Některé proteiny běžně obsažené v P-tělískách lokalizují v plně dorostlých oocytech do kortikální oblasti. Spolu s dalšími RNA-vazebnými faktory vytvářejí tyto proteiny ve finální fázi oocytárního růstu sub- kortikální...
|
|
|
Vliv sulfanu na stárnutí prasečích oocytů in vitro
Krejčová, Tereza ; Petr, Jaroslav (vedoucí práce) ; Ješeta, Michal (oponent)
Prasečí oocyty, dozrálé v in vitro podmínkách, které nejsou oplozeny nebo partenogeneticky aktivovány, podléhají procesu, označovanému jako stárnutí. Během stárnutí oocytů dochází ke komplexu strukturních a funkčních změn, které u prasečích oocytů mohou vyústit ve spontánní partenogenetickou aktivaci, fragmentaci či lýzu. V našich kultivačních podmínkách po 3 dnech stárnutí zůstává 23% oocytů ve stádiu metafáze II, 48% je spontánně partenogeneticky aktivováno, 26% oocytů podléhá fragmentaci a 3% oocytů lyzují. Kultivací oocytů v médiu s přídavkem donoru sulfanu Na2S v koncentracích 150 µM a 300 µM dochází k úplnému potlačení fragmentace oocytu během stárnutí prasečích oocytů. Inhibicí enzymů katalyzujících v oocytu syntézu sulfanu (cystathionin-β-syntázy a cystathionin-γ-lyázy) dochází v průběhu stárnutí k časnějšímu nástupu fragmentace oocytů. Efekt obou inhibitorů lze kompletně zvrátit použitím donoru sulfanu Na2S. Proces stárnutí u prasečích oocytů významně ovlivňuje i úspěšnost aktivačních postupů. U prasečích oocytů, které nebyly vystaveny stárnutí, došlo k partenogenetické aktivaci u 94 % z nich. Po vystavení prasečích oocytů 24 hodinám stárnutí poklesl podíl aktivovaných oocytů na 80%. Vystavení prasečích oocytů 24 hodinám stárnutí v přítomnosti donoru sulfanu vyvolalo další pokles v podílu...
|
|
|
Analysis of short Argonaute isoforms from mouse oocytes
Jankele, Radek ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Analýza kratkých isoforem proteinů Argonaůt z mýsích oocýtů Abstrakt: Proteiny z rodiný Argonaůtů, řízené malými molekůlami RNA, představůjí konzervované jádro mechanismů ůmlčování RNA (RNA silencing). Týto mechanismý potlačůjí prodůkci virů, šíření mobilní DNA, a regůlůjí genovoů expresi na základě sekvenční informace nesené asociovanou RNA. V somatických bůňkách savců je dominantním mechanismem regůlační microRNA (miRNA) dráha. Malé miRNA ovlivňůjí expresi většiný savčích genů. Argonaute proteiny inhibůjí translaci a indůkůjí deadenylaci mRNA s částečnoů homologií k navázané miRNA. Deadenylace obvykle výústí degradaci mRNA. Těmito mechanismý miRNA dráha citlivě kontrolůje hladiný prodůkovaných proteinů. Na rozdíl od příbůzného mechanismů RNA interference (RNAi) výůžívajícího katalyticky aktivní proteiny Argonaute schopné rozštěpit komplementárních molekuly RNA, miRNA ůmlčování je závislé na celé řadě dalších faktorů. Role miRNA regulace v komplexních biologických procesech od organogeneze, přes krvetvorbů až po rakovinu je dobře doložená. Mýší oocýtý postrádající kanonické miRNA jsoů překvapivě schopné oplození a úspěšně projdoů preimplantačním vývojem. Ani nejčetnější oocýtární miRNA však nejsou sto efektivně ůmlčet cílové gený, přestože příbůzný mechanismůs RNAi, sdílející s miRNA mechanismem klíčové...
|
|
|
Časo-prostorové utváření molekulárních gradientů v časném embryonálním vývoji Xenopus laevis.
Šídová, Monika ; Tlapáková, Tereza (vedoucí práce) ; Pěknicová, Jana (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Detailní pochopení vývoje nového jedince zavisí na objasnění časo- prostorových mechanismů, které určují tělní plán. Z tohoto důvodu klíčovou otázkou časného embryonálního vývoje obratlovců stále zůstává, kdy a jak dochází k determinaci a diferenciaci jednotlivých buněk, což posléze vede ke specifikaci tělní osové polarity a založení základů všech orgánů a tkání. Odpověď na tuto otázku přinese nové možnosti využití nejen pro primární výzkum, ale i pro obor aplikované medicíny. Hlavní cíl předkládané disertační práce spočíval ve stanovení časo- prostorových molekulárních gradientů buněčných determinantů v průběhu časného embryonálního vývoje. Jako modelový organismus byla zvolena africká drápkatá žába, druh Xenopus laevis, která disponuje dostatečně velkými oocyty a vnější embryogenezí. Vzhledem k pozdní aktivaci embryonálního genomu se předpokládá, že stěžejní mechanismus počáteční determinace buněk závisí na nerovnoměrné lokalizaci maternálních faktorů uvnitř oocytu a jejich asymetrické distribuci do dceřiných blastomer v průběhu rýhování. Pomocí metody qPCR tomografie byly identifikovány dva hlavní lokalizační gradienty s preferencí buď v animální, nebo vegetativní hemisféře zralého oocytu. Tyto gradienty se shodovaly jak pro maternální mRNA, tak i pro miRNA molekuly. U maternální mRNA navíc...
|
|
|
Psychosociální problematika infertility verbalizovaná pacienty ambulance pro léčbu neplodnosti.
DVOŘÁKOVÁ, Alena
Neplodnost (infertilita) je definována jako neschopnost otěhotnět po roce pravidelného nechráněného pohlavního styku. Existuje mnoho příčin neplodnosti, obě pohlaví jsou zastoupena stejně. Neplodnost je dnes pokládána za stresující životní okolnost, která vyvolává sérii psychosociálních reakcí. Ovlivňuje životní pohodu člověka a jeho schopnost normálně komunikovat a jednat. V atmosféře běžného společenského očekávání, že manželskému páru se mají rodit děti, je rodičovství chápáno dokonce jako jakási morální povinnost. Pokud není toto očekávání naplněno, pár se začne odlišovat a pociťovat stigmatizující efekt. Nejčastěji užívanou metodou léčby neplodnosti je in vitro fertilizace (IVF). Metoda spočívá v hormonální stimulaci vaječníků pacientky k vývoji a dozrání většího počtu vajíček. Vajíčka se po dosažení optimálního stupně vývoje získávají z vaječníků transvaginální punkcí a aspirací. Získaná vajíčka se oplodní spermiemi partnera. Po několikadenní kultivaci jsou embrya přenesena do dělohy ženy. Zvolená výzkumná strategie byla kvalitativní. Metodami získání dat byl neřízený rozhovor a pozorování. Sledovaný soubor tvořilo deset párů navštěvujících ambulanci pro léčbu neplodnosti. Tato práce si kladla za cíl zmapovat psychosociální problematiku infertilních párů. Otázky rozhovoru byly zaměřené na partnerské vztahy. Studie zdůrazňuje, že neplodnost je nemoc páru a že pokud se muž aktivně zapojuje do léčby, je to pro posílení vztahu velmi přínosné. Další okruh otázek byl zaměřen na komunikaci pacientů s rodinou a přáteli. Autorka sledovala i obtížnost zkombinování léčby se zaměstnáním. Hlavní důraz výzkumu byl zaměřen na zvládání léčby, na to, co pacientům léčbu usnadňuje a jak jim pracovníci center asistované reprodukce mohou pomoci léčbu lépe zvládat. Studie upozorňuje na nutnost tolerance a empatie personálu vůči pacientům. Dále poukazuje na možnosti optimálnější organizace v centrech a na užití vhodné terminologie. Práce může být využita hlavně pracovníky center asistované reprodukce.
|
host ::
RSS.