|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
|
|
Příprava rekombinantního cytochromu P450 1A1
Dvořák, Martin ; Svášková, Dagmar (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
4 Abstrakt Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) je jednou z hlavních isoforem z celé "superrodiny" cytochromů P450 (CYP). Jedná se zejména o extrahepatální enzym, který se podílí na oxidaci mnoha polycyklických aromatických uhlovodíků a jiných xenobiotik. Vedle úlohy v detoxifikačním metabolismu je bohužel CYP1A1 také jeden z nejvýznamnějších CYP v aktivaci prokarcinogenů. Cílem této práce bylo připravit pomocí genové syntézy s optimalizací kodónů pro expresi v E. coli dvě různé varianty genu kódujícího potkaní CYP1A1, tj. "wild type" (wt1A1) a s pozměněnou N-terminální kotvou (mod1A1) (u obou pak modifikace s nebo bez His kotvy na C-konci), porovnat jejich expresi v různých typech buněk E. coli a případně se pokusit o purifikaci a srovnání enzymové aktivity genových produktů. Z navržených oligonukleotidů byly syntetizovány 2 "syntony" (části genu), vloženy samostatně do plasmidu pUC19, po ověření sekvence "vyštěpeny", spojeny a vloženy do expresního plasmidu pET-22b. Takto připravenými vektory byly transformovány 3 kmeny buněk E. coli, a to BL-21 (DE3) GOLD, RIL a RIPL. Byly testovány různé podmínky produkce požadovaných proteinů: teplota (18, 22, 24, 27 a 37 řC), čas produkce (až 48 hodin), koncentrace IPTG (0,1; 0,2; 0,5 a 1mM), OD600 při indukci (0,4; 0,6; 0,8; 0,9 a 1) a přidání ALA (0, 30, 60, 120 nebo 150...
|
|
|
Hydrogely na bázi kladně nabitých poylelektrolytů
Jarábková, Sabína ; Lehocký,, Marián (oponent) ; Pekař, Miloslav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá studiem fyzikálních hydrogely na bázi kladně nabitých polyelektrolytů. Předmětem studia je prozkoumání interakcí vybraných kladně nabitých polyelektrolytů s opačně nabitými tenzidy ve vodě a ve fyziologickém roztoku (0,15 M NaCl). Byl zkoumán vliv způsobu přípravy na tvorbu hydrogelů. Hydrogely byly připravovány metodou suché nebo mokré cesty. Byly testovány solubilizační schopnosti připravených hydrogelů pomocí hydrofobního barviva olejové červeně O. Dále byly měřeny reologické vlastnosti připravených hydrogelů pomocí frekvenčních oscilačních testů a tokových testů v závislosti na zvolené koncentraci polymeru nebo tenzidu. Z reologických experimentů vyplývá, že chitosan je schopen tvořit rigidnější hydrogely s lepšímí mechanickými vlastnostmi než dextran, v přítomnosti obou tenzidů. U vybraných vzorků byly provedeny také fluorescenční experimenty za použití prodanu, nilské červeně a -naftolu jako fluorescenčních sond. A u vybraných experimentů byl stanovován obsah sušiny v procentech v závislosti na koncentraci použitých polyelektrolytů nebo tenzidů.
|
|
|
Solubilizace v sonografických systémech
Überall, Martin ; Klučáková, Martina (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
V diplomové práci byly pomocí metody UV-VIS spektrofotometrie studovány solubilizační schopnosti fosfolipidů, z nichž je tvořen komerční přípravek SonoVue® využívájící se v ultrasonografii, a poté samotných mikrobublin stejného složení jako má SonoVue®, připravených různými způsoby v naší laboratoři. Byla zjišťována koncentrace látek solubilizovaných uvnitř zmíněných systémů. Prvním studovaným fosfolipidem byl dipalmitoyl¬fosfatidylglycerol sodný a druhým distearoylfosfatidylcholin. Mikrobubliny byly připraveny z těchto dvou fosfolipidů s přídavkem polyethylenglykolu a kyseliny palmitové dle přípravku SonoVue®. Solubilizační schopnosti byly zkoumány pomocí hydrofobních solutů Sudan Red G, Oil Red O, 4-(4-Diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium jodidu a Nilské červeně. Tyto látky byly vybrány z důvodu získání modelového systému solubilizovaných léčiv, popřípadě jiných účinných látek, které jsou taktéž hydrofobního charakteru. Solubilizace jednotlivých solutů byla zkoumána v mírně polárním prostředí fyziologického roztoku (0,15 M roztok NaCl). Dále byla provedena vizualizace námi připravených mikrobublin pomocí optické a fluorescenční mikroskopie. 4-Di-2-Asp nebyla vhodná fluorescenční sonda k vizualizaci mikrobublin. Velikost námi připravených mikrobublin odpovídala velikosti mikrobublin komerčního přípravku SonoVue®. Bylo zjištěno, že koncentrace solubilizovaných hydrofobních solutů uvnitř lipozomů fosfolipidů odpovídá řádově desítkám až stovkám mikromolů na litr. S rostoucí koncentrací fosfolipidů roste koncentrace solubilizovaných solutů. Výsledky získané během této práce mohou být využity k dalším experimentům a výzkumu v oblasti zaměřené na solubilizaci léčiv v mikrobublinách, kontrastních látkách, které jsou využívány v ultrasonografii.
|
|
|
Solubilizační vlastnosti komplexů hyaluronan - tenzid
Malá, Michaela ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Venerová, Tereza (vedoucí práce)
V rámci této diplomové práce byl zkoumán systém hydrogelů na bázi polyelektrolyt-amfifilní molekula a to zejména jejich solubilizační vlastnosti. Jako tenzid byl použit ionogenní kationaktivní cetyltrimetylamoniumbromid (CTAB). Polyelektrolytem byl nativní anionaktivní hyaluronan o různých molekulových hmotnostech - 0,3; 0,9; 1,6 MDa a různé koncentraci - 2%, 4%, 6% hmot. Solubilizační experimenty byly provedeny s použitím hydrofobního barviva sudánová červeň. Celý systém byl připravován v nejjednodušším modelovém systému fyziologického roztoku 0,15 M NaCl a ve vodě. U připravených gelů byla zkoumána jejich stabilita, vliv prostředí, molekulové hmotnosti a koncentrace hyaluronanu na solubilizaci. Gely byly připravovány v poměru hyaluronan-tenzid 1:1. Cílem práce bylo naleznout a optimalizovat vhodný postup pro určení solubilizačních schopností pomocí UV-VIS spektrofotometrie.
|
|
|
Solubilizační schopnosti polysacharidů
Lenartová, Radka ; Foglarová, Marcela (oponent) ; Pekař, Miloslav (vedoucí práce)
V diplomové práci byly studovány solubilizační schopnosti polysacharidů, které byly představovány alkylovými deriváty kyseliny hyaluronové, pomocí hydrofóbních solutů (Sudan Orange G, Sudan Red G, (±)-alfa-tokoferol, pyren, perylen, Nilská červeň). Nejdříve bylo zkoumáno chování jednotlivých solutů v prostředích s různou polaritou (methanol, 1 propanol, chloroform, cyklohexan, n-heptan) a iontovou silou (voda, 0,1 M a 0,4 M NaCl). Poté byly zkoumány schopnosti modelového systému dodecyl síranu sodného solubilizovat tyto hydrofóbní látky uvnitř micel. Zajímala nás solubilizační kapacita, která byla definovaná jako mol solublilizované látky na mol micel tenzidu, odpovídající stavu nasycení micel. V případě solubilizace (±)-alfa-tokoferolu v micelách SDS nebylo možné určit solubilizační kapacitu, proto jsme přešli na určování obecnější solubilizační síly, která je definovaná jako mol solubilizované látky na mol tenzid. Tato hodnota je vztažena na příslušné množství solubillizující látky při stavu nasycení micel. Modelový systém tenzidu dodecyl síranu sodného byl volen proto, protože se jedná o jednoduchý tenzid nesoucí záporný náboj stejně jako alkylové deriváty hyaluronanu, který formuje unimolární micely a hodntoty kritické micelární koncentrace a agregačního čísla ve zvolených prostředích jsou tabelovány. Hlavní podstatou práce bylo stanovení vlastností hydrofóbních domén alkylových derivátů hyaluronanu jako volné místo pro začlenění hydrofóbních látek v prostředích s různou iontovou silou. Kritické agregační koncentrace byly stanoveny pomocí fluorescenční sondy pyrenu a jeho metody poměru 1:3. Pro výzkum mikropolarity domén derivátů hyaluronanu byly zvoleny dvě koncentrace derivátů. Jedna těsně nad stanovenou kritickou agregační koncentrací a druhá o něco vyšší. Byl zkoumán vliv koncentrace pyrenu na mikropolaritu domén. Zjistili jsme vliv koncentrace pyrenu. Na druhou stranu jsme našli stabilní oblast koncentrací, které mikropolaritu neovlivňují. Nakonec jsme zkoumali vliv přípravy roztoků derivátů hyaluronanu na mirkopolaritu prostředí pomocí zvolené koncentrace pyrenu odpovídající stabilním oblastem. Studium solubilizačních vlastností derivátů hyaluronanu není jednoduché, jak jsme předpokládali. Při měření absorbancí prostředí o vyšších koncentrací hyaluronanu, kdy jsme předpokládali nasycení micel solubilizovanou látkou působilo rušivě, že zastiňovalo měření absorbance solubilizovaných látek. Z experimentu solubilizace s látkou Sudan Red G jsme zjistili, že nedocházelo k jeho solubilizaci v micelách derivátu hyauronanu z efektu nízké lipofility micelárního jádra a případných sterických efektů. Proto jsme zvolili perylen jako další solubilizující látku. Při solubilizaci perylenu jsme z emisních spekter našli nasycení micel a proto jsme mohli pro danou koncentraci perylenu vyjádřit solubilizační sílu derivátů hyaluronanu. Cílem celé práce bylo stanovit optimální způsob přípravy roztoků derivátu hyaluronanu, aby zabezpečoval požadovanou úroveň solubillizace.
|
|
|
Colloid properties of hyaluronane sols
Krouská, Jitka ; Mašek, David (oponent) ; Pekař, Miloslav (vedoucí práce)
The objective of this thesis was to describe aggregation properties of hyaluronic acid (HA) and its hydrophobically modified derivates. For this purpose, two HA derivates in aqueous solutions differing in degree of substitution and anorganic salt environment were prepared. The concentration series of pure HA and its derivates were studied by two methods, tensiometry and spectrophotometry. The surface properties were measured with Du Noüy ring. The solubilization behaviour in water and sodium chloride media was also investigated with the probes, the Coomassie Brilliant Blue and Sudan III dyes. The result is that the amphiphilic HA derivates may indeed establish hydrophobic associations in bulk solution while adsorbing at the air–water interface. This property is important when talked about drug delivery systems, because the hydrophobic domains in the aggregates of HA derivates may be used as a delivery system for hydrophobic drugs. Critical aggregation concentrations of HA derivates were obtained from tensiometric and spectrophotometric measurement and these concentrations correspond directly to the concentration in which the hydrophobic domains occur.
|
|
|
Transport biomedicínsky aktivních látek skrz porézní membrány
Vašíčková, Kateřina ; Smilková, Marcela (oponent) ; Smilek, Jiří (vedoucí práce)
Náplní této bakalářské práce je studium transportu biomedicínsky aktivních látek skrz porézní membrány. Hlavní cílem je otestovat a optimalizovat metodu penetrace micelárních roztoků vybraného tenzidu se solubilizovaným barvivem a v dalším kroku i se solubilizovaným léčivem. Vybraným tenzidem schopným tvorby micel je bromid cetyltrimethylamonný (CTAB) a jako modelová difúzní a fluorescenční sonda slouží barvivo nilské červeně. Solubilizovanou aktivní látkou je nesteroidní protizánětlivé léčivo ketoprofen s analgetickými a antipyretickými účinky. Difúzní procesy jsou realizovány ve vertikálních Franzových difúzních celách s polykarbonátovou membránou, jejíž velikost pórů je 2 µm. Během difúze jsou odebírány vzorky ve zvolených časových intervalech a následně vyhodnocovány metodou fluorescenční korelační spektroskopie (FCS). Pomocí této metody je možné monitorovat probíhající difúzi v čase a to i při velmi nízkých, nanomolárních koncentracích vybrané fluorescenční sondy. Práce poskytuje přehled o chování nilské červeně v micelárním roztoku tenzidu při difúzních procesech a dále možnost rozšíření experimentu o použití aktivní látky, např. již zmíněného ketoprofenu.
|
|
|
Studium systémů založených na fosfolipidech pro sonografické aplikace.
Überall, Martin ; Krouská, Jitka (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
V bakalářské práci byly pomocí metody UV-VIS spektrofotometrie studovány solubilizační schopnosti povrchově aktivních látek a fosfolipidů. Byla zjišťována koncentrace látek solubilizovaných uvnitř zmíněných systémů. Zástupcem povrchově aktivních látek byl zvolen cetyltrimethylamonium bromid (CTAB), sodium dodecylbenzensulfonát (SDBS) a Triton X-100. Zástupcem fosfolipidů byl zvolen lecithin a komerčně dostupný přípravek SonoVue®. Solubilizační schopnosti byly zkoumány pomocí hydrofobních solutů Sudan Red G (SRG), Oil Red O (ORO) a 1-naphtolu z důvodu získání modelového systému solubilizovaných léčiv, popřípadě vitaminů, které jsou taktéž hydrofobního charakteru. Chování jednotlivých solutů v tenzidech bylo zkoumáno v mírně polárním prostředí fyziologického roztoku (0,15 M roztok NaCl), chování solutů v lecithinu bylo naopak zkoumáno v prostředí Mili-Q vody. Bylo zjištěno, že koncentrace solubilizovaných hydrofobních solutů uvnitř micel tenzidů odpovídá řádově desítkám až stovkám mikromolů na litr. S rostoucí koncentrací tenzidů roste koncentrace solubilizovaných solutů. Výsledky získané během této práce mohou být využity k dalším experimentům či výzkumu v oblasti zaměřené na solubilizaci léčiv v kontrastních látkách využívaných v ultrasonografii.
|
|
|
Modelové aplikační systémy pro léčiva nerozpustná ve vodě
Sapárová, Alica ; Holínková, Petra (oponent) ; Pilgrová, Tereza (vedoucí práce)
Pomocou metódy UV-VIS spektrofotometrie bola študovaná solubilizačná schopnosť systému micela–hyaluronan. Ako tenzid bol zvolený Septonex a bol použitý hyaluronan o štyroch molekulových hmotnostiach. Solubilizačné pokusy boli vykonané pomocou hydrofóbnych farbív Sudánu Red G a Sudánu III z dôvodu získania modelového systému solubilizovaných liečiv, ktoré sú tiež hydrofóbneho charakteru. Celý systém bol pripravovaný v prostredí mili-Q vody. Bol skúmaný vplyv molekulovej hmotnosti hyaluronanu na solubilizačnú schopnosť. Bolo zistené, že s rastúcou koncentráciou micel rastie aj koncentrácia solubilizovaných farbív a molekulová hmotnosť hyaluronanu má vplyv na rozpustnosť farbív.
|
host ::
RSS.