|
|
Příprava myšího interleukinu 2 spojeného s monoklonální protilátkou S4B6
Rožová, Dominika ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Interleukin 2 je růstový faktor T buněk, ale i dalších lymfocytů, jako jsou NK, NKT buňky, dendritické a žírné buňky, které zajišťují jeho expresi a sekreci. IL-2 reguluje homeostázu imunitních buněk a používá se k léčbě řady poruch včetně rakoviny a autoimunitních chorob. V posledních letech bylo popsáno několik případů, kdy komplex interleukinu 2 s protilátkou anti-IL2 vykazoval mnohonásobně vyšší biologickou aktivitu in vivo. Tyto komplexy mají selektivní stimulační aktivitu pro různé receptory cílových buněk. Tato práce navazuje na předchozí neúspěšné pokusy o expresi a purifikaci dostatečného množství imunokomplexu myšího IL2 s protilátkou S4B6 spojenou 15 aminokyselinovou glycin-serinovou spojkou. V rámci této práce byl připraven plazmid obsahující gen pro fúzní sekretovaný imunokomplex mIL2-S4B6, kterým byla následně stabilně transfekována buněčná linie HEK293T pomocí systému piggyBac. Protein byl následně izolován chelatační afinitní chromatografií a purifikován gelovou permeační chromatografií.
|
|
| |
|
|
Příprava reportérové buněčné linie pro ověření biologické aktivity rekombinantních proteinů
Kozojedová, Petra ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky patří mezi imunitní buňky zprostředkovávající nespecifickou imunitní odpověď organismu. Exprimují na svém povrchu řadu ligand-specifických aktivačních či inhibičních receptorů, mezi které patří přirozeně cytotoxický aktivační receptor NKp30, indukující po interakci s ligandem cytotoxickou odpověď. Receptor NKp30 má jednu ligand vazebnou imunoglobulinu podobnou extracelulární doménu s krátkou "stalk" doménou, která umožňuje oligomerizaci extracelulární domény receptoru NKp30, což vede k posílení interakce ligand- receptor a ovlivnění signalizace vedoucí k aktivaci buňky. Tato práce se zabývá přípravou konstruktů inspirovaných technologií chimerních antigenních receptorů nesoucích extracelulární doménu receptoru NKp30 se "stalk" doménou či pouze ligand vaznou doménu pro ověření biologické aktivity konstruktů po expresi na buněčné membráně. Byly připraveny dva vektory pro expresi konstruktů inspirovaných chimerními antigenními receptory s geny pro extracelulární doménu receptoru NKp30. Pro ověření biologické aktivity různých konstruktů byla plasmidová DNA kódující připravené konstrukty transientně transfekována do buněk Jurkat. Klíčová slova: NK buňky, NKp30, reportérová buněčná linie, rekombinantní protein, chimerní antigenní receptor
|
|
|
Mutageneze a exprese proteinu NKp80, aktivačního receptoru lidských lymfocytů
Pazderová, Kristýna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Předmětem této práce je receptor NKp80, také známý jako KLRF1 (z angl. killer cell lectin-like subfamily F, member 1). Je to aktivační receptor tvořící homodimery na povrchu NK buněk. Váže se na ligand AICL, který se přirozeně nachází na myeloidních buňkách. Pokud dojde k výraznému navýšení exprese ligandu AICL, např. na nádorových buňkách, stává se buňka terčem pro NK buňky, které exprimují receptor NKp80. Komplex NKp80:AICL je potenciálním cílem imunoterapeutické léčby myeloidní leukémie. Cílem práce byla produkce a purifikace extracelulární domény receptoru NKp80 a jejích variant, kde v její části tzv. "stalk" oblasti byly jednotlivé cysteiny nahrazeny seriny. Pomocí zavedených mutací zde byl sledován vliv na tvorbu homodimerů. Proteiny byly produkovány za použití stabilně transfekovaných linií buněk HEK293S GnTI-. Celkem bylo produkováno sedm mutantů se všemi možnými kombinacemi mutací tří cysteinů "stalk" oblasti. Proteiny pak byly analyzovány pomocí analytické gelové permeační chromatografie, diferenční skenovací fluorimetrie, a nakonec byla pomocí deglykosylace ověřena přítomnost více glykosylačních forem receptoru NKp80. Z výsledků je zřejmé, že u žádné varianty receptoru NKp80 nedochází ke tvorbě kovalentních homodimerů, ale z hodnoty elučního objemu proteinu můžeme předpokládat, že v...
|
|
|
Optimalizace CAR T lymfocytů pro imunoterapii hematologických malignit
Mucha, Martin ; Otáhal, Pavel (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Imunoterapie založená na T lymfocytech exprimujících chimerické antigenní receptory (CAR) se ukázala být velice úspěšnou v léčbě akutní lymfoblastické leukémie (ALL), což vedlo ke snaze vyvinout imunoterapeutické postupy založené na CAR T lymfocytech i pro další hematologické malignity. V současné době je snaha vylepšit modifikace T lymfocytů tak, aby léčba pacientů byla efektivnější. Pokaždé je pak třeba tuto modifikaci empiricky ověřit v pokusech in vitro. Rozhodli jsme se studovat efekt cytokinu IL-21 na protinádorovou funkci CD19 specifických CAR T lymfocytů pomocí in vitro testů. Do T buněk byl vnesen konstrukt, který koexprimoval IL-21 pod kontrolou inducibilního NFAT promotoru společně s CAR proti CD19. V sérii experimentů byly porovnávány vlastnosti těchto buněk po kokultivaci s nádorovými B buněčnými liniemi a buňkami CLL získané od pacientů. Z výsledků vyplývá, že CAR T buňky, které exprimují IL-21, lépe proliferují a lépe se aktivují, a to i po opakované stimulaci leukemickými buňkami. Kromě CARů specifických proti molekule CD19 jsme se zabývali i CARy specifickýmiproti molekule CLL1, která je v literatuře popisována jako jeden ze slibných targetů pro léčbu AML. Připravili jsme CAR T buňky proti CLL1 produkující IL-21. Pro tento účel bylo třeba připravit plazmid, který kromě sekvence pro...
|
|
|
Interaction of a surface marker of immune cells with low-molecular weight ligands and their polymer conjugates
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Každý rok zemřou na rakovinu miliony lidí po celém světě. V posledním desetiletí nabízí imunoterapie nové léčebné přístupy s dlouhotrvajícími remisemi u řady pa- cientů. Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (Food and Drug Administration, FDA) schválil několik nových léčiv založených na imunoterapii. Nicméně, pro většinu pacientů je tato léčba neúčinná, případně se nemoc brzy znovu projeví. Slibně se dnes jeví hledání a zkoumání nových kontrolních bodů imunitního systému a léčba kombinující cílení různých těchto bodů. Tato práce se zaměřuje na nový cíl imunoterapie - CD73. CD73 je membránová ektonukleotidasa, vysoce exprimovaná v regulačních leukocytech a v rakoviných buňkách. Svojí enzymatickou aktivitou, tvorbou imunosupresivního adenosinu, přispívá k vytváření nádorového mikroprostředí. Tento nový kontrolní bod imu- nitního systému je proto intensivně studován. Cílem této práce je vývoj nových metod cílení a inhibice CD73. Rozpustná forma rekombinantní lidské CD73 (rhCD73) byla připravena v savčím expresním systému, dále byla také připravena buněčná linie stabilně exprimující CD73 na svém povrchu. Inhibitory potřebné pro oba zmíněné cíle byly navrženy na základě struktury publikovaného inhibitoru CD73. Protilátkové mimetikum pro charakterisaci CD73 bylo vyvinuto a evaluováno. Tento HPMA polymerní...
|
|
|
Vliv nádorového mikroprostředí, buněčné a humorální imunity na patogenezi nádorových onemocnění.
Špaček, Jan ; Závadová, Eva (vedoucí práce) ; Petráková, Katarína (oponent) ; Kopečková, Kateřina (oponent)
Onkologická onemocnění jsou druhou nejčastější příčinou úmrtí v České republice. Na předních příčkách příčiny úmrtí stojí karcinom prsu a kolorektální karcinom. Jednou ze základních oblastí současného klinického výzkumu v onkologii, který má za cíl optimalizovat rozhodování o dalším terapeutickém postupu u konkrétního nemocného, je studium prognostických biomarkerů. Imunitní reakce a procesy v nádorovém mikroprostředí podle posledních poznatků do značné míry ovlivňují biologickou povahu nádoru ve smyslu jeho agresivity a schopnosti metastazovat v organismu hostitele. Existují určité nádory, které mají schopnost indukovat silnou imunitní reakci a jiné naproti tomu nikoli. Ukazuje se, že schopnost navodit protinádorovou buněčnou reakci a atrahovat specifické subpopulace T lymfocytů přímo do nádorové tkáně je velmi úzce spojena s prognózou onkologických pacientů. Existují důkazy o vzájemném vztahu přítomnosti tumor infiltrujících lymfocytů v nádorové tkáni a délkou přežití onkologického pacienta, tedy mírou agresivity primárního tumoru. Stratifikace pacientů s onkologickým onemocněním na základě imunoprediktorů jak v séru, tak přímo v nádorovém mikroprostředí umožňuje identifikovat vhodné kandidáty pro moderní protinádorovou imunoterapii, která je již v současnosti standardní terapeutickou modalitou....
|
|
|
Význam povrchové exprese proteinu Tim-3 na buňkách akutní myeloidní leukémie
Kořánová, Tereza ; Kuželová, Kateřina (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent)
Akutní myeloidní leukémie (AML) je nádorové onemocnění krvetvorby, charakteristické produkcí nefunkčních prekurzorů myeloidní buněčné řady. Mutace maligním buňkám poskytují schopnost proliferovat nezávisle na růstových faktorech a odolnost vůči indukci buněčné smrti. Součástí maligní transformace bývá také schopnost uniknout zásahu imunitního systému. T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3 (Tim-3) byl původně objeven na povrchu imunitních buněk, kde působí jako inhibitor jejich aktivity. Později byla zjištěna přítomnost Tim-3 také na leukemických buňkách, kde zatím jeho funkce není detailně popsána. Po vazbě galektinu-9 (Gal-9) působí Tim-3 na AML blastech jako aktivační receptor. Signalizace od komplexu Tim-3/Gal-9 vede ke stimulaci NF-κB, β-cateninu, HIF-1, PKC a mTOR drah, které v jisté míře suplují funkci růstového faktoru. Podporují neustálou obnovu leukemických buněk, poskytují stimulační signály a pozitivní zpětnou vazbou dále zvyšují i produkci a sekreci Tim-3 a Gal-9. Důležitou funkcí Tim-3 je i transport a lokalizace Gal-9, který interakcí s Tim-3 na povrchu T lymfocytů blokuje jejich aktivaci, znemožňuje tvorbu imunologické synapse a výkon efektorových funkcí, podporuje vyčerpaný stav a dokonce indukuje apoptózu. U NK buněk Gal-9 tlumí imunoaktivační geny a inhibuje...
|
|
|
Význam složení a funkčních vlastností imunitního infiltrátu nádorového mikroprostředí pro klinický průběh nádorů hlavy a krku
Hladíková, Kamila ; Špíšek, Radek (vedoucí práce) ; Plzák, Jan (oponent) ; Reiniš, Milan (oponent)
Nádory hlavy a krku představují z imunologického hlediska velmi komplexní a heterogenní skupinu onemocnění. Původně byly tyto nádory spojovány především s kouřením a alkoholem. V posledních desetiletích ale výrazně narůstá procento nádorů asociovaných s perzistující infekcí lidským papilomavirem s onkogenním potenciálem v imunologicky privilegované oblasti tonzilárních krypt. Vzhledem k nezastupitelné roli imunitního systému, jak v protivirové, tak v protinádorové imunitní odpovědi je prognóza pacientů významně ovlivněna velikostí, složením a funkční kapacitou imunitního infiltrátu v nádorovém mikroprostředí. Pro nádory hlavy a krku je charakteristické silně imunosupresivní prostředí, zhoršující průběh onemocnění a snižující účinnost imunoterapie. Většina pacientů s touto diagnózou dobře odpovídá na standardní terapii, ta je ale spojená s velmi závažnými časnými a pozdními toxicitami, které mají zásadní vliv na kvalitu života. V roce 2016 byla schválena první imunoterapeutika pro léčbu refrakterních nádorů hlavy a krku - inhibitory kontrolních bodů imunitních reakcí blokující PD-1 - PD-L1 dráhu, nivolumab a pembrolizumab. Tento druh terapie, založený na odblokování imunosuprese, se v protokolech kombinujících více léčebných modalit ukázal být velmi účinný a zároveň výrazně méně toxický oproti...
|
|
|
Příprava myšího interleukinu 2 spojeného s monoklonální protilátkou S4B6
Rožová, Dominika ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Interleukin 2 je růstový faktor T buněk, ale i dalších lymfocytů, jako jsou NK, NKT buňky, dendritické a žírné buňky, které zajišťují jeho expresi a sekreci. IL-2 reguluje homeostázu imunitních buněk a používá se k léčbě řady poruch včetně rakoviny a autoimunitních chorob. V posledních letech bylo popsáno několik případů, kdy komplex interleukinu 2 s protilátkou anti-IL2 vykazoval mnohonásobně vyšší biologickou aktivitu in vivo. Tyto komplexy mají selektivní stimulační aktivitu pro různé receptory cílových buněk. Tato práce navazuje na předchozí neúspěšné pokusy o expresi a purifikaci dostatečného množství imunokomplexu myšího IL2 s protilátkou S4B6 spojenou 15 aminokyselinovou glycin-serinovou spojkou. V rámci této práce byl připraven plazmid obsahující gen pro fúzní sekretovaný imunokomplex mIL2-S4B6, kterým byla následně stabilně transfekována buněčná linie HEK293T pomocí systému piggyBac. Protein byl následně izolován chelatační afinitní chromatografií a purifikován gelovou permeační chromatografií.
|
host ::
RSS.