|
|
Effect of bacterial monoassociations (Akkermansia muciniphila) on development of type 1 diabetes and immune parameters in ex-germ-free NOD mice
Němec, Dušan ; Funda, David (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Diabetes 1. typu (T1DM) je autoimunitní onemocnění postihující asi 0,4 % běžné populace a jeho prevalence stále stoupá. T1DM je multifaktoriální onemocnění a vyvíjí se pod vlivem různých faktorů prostředí a genetického pozadí. Střevní mikrobiota je v poslední době jedním z nejdůležitějších environmentálních rysů autoimunity, včetně T1DM. Zdravá střevní mikrobiota se vyznačuje zejména svou variabilitou. V poslední době vzniká snaha určit kriticky důležité bakterie, které mohou buď řídit nebo potlačovat vývoj T1DM a jiných autoimunit. Akkermansia muciniphila patří mezi zmiňované potenciálně protektivní bakterie. Tato diplomová práce se zabývala změnami imunitních parametrů, jako jsou regulační T buňky, NK buňky, γδ T buňky a exprese IFNγ, IL-10 a IL-17, a jejich korelaci s nástupem T1DM u A. muciniphila-monoasociované ex-germ-free NOD myši ve srovnání s kontrolami germ-free (GF) a specific-pathogen-free (SPF) myšmi. Druhá část práce, tedy adoptivní přenos buněk do NOD-SCID modelu demonstrovala, zda se odlišují diabetogenní vlastnosti splenocytů odvozených od NOD myší asociovaných s A. muciniphila oproti GF a SPF kontrole. Menší rozdíly byly nalezeny v imunitních parametrech mezi různými buněčnými populacemi, s nejvýraznější zvýšenou expresí IL-10 u myší monoasociovaných s A. muciniphila ve srovnání s...
|
|
|
CRISPR/Cas9 editing of leukemic B-cells: searching for microRNA-155 targets involved in the process of leukemogenesis
Sypecká, Markéta ; Savvulidi Vargová, Karina (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Editace leukemických B-buněk pomocí CRISPR/Cas9: hledání cílů miR-155 účastnících se procesu leukemogeneze Úvod: Chronická lymfocytární leukémie (chronická lymfoidní leukémie, CLL) je monoklonální porucha charakterizovaná postupnou akumulací funkčně nekompetentních B- lymfocytů. CLL je nejběžnější formou leukémie u dospělých v západních zemích. Průběh onemocnění se může lišit: někteří pacienti umírají rychle, během 2-3 let od diagnózy, převážně kvůli komplikacím z CLL, ale většina pacientů žije 5-10 let. S progresi nemoci stoupá exprese miR-155, která je označována jako oncomiR. MikroRNA (miRNA) představují negativní regulátory genové exprese. MiR-155 ovlivňuje geny, které se účastní leukemogeneze a buněčného cyklu. A je známo, že miR-155 (podobně jako i jiné miRNA) potlačuje své cíle. Předpokládali jsme, že úpravou genů v CLL bunkách odblokujeme cíle miR-155 a zjistíme korelaci mezi těmito cíli (známými a neznámými) s leukemogenezí CLL. Metody: Metodu, kterou jsme použili pro editaci genů, je CRISPR/Cas9, která umožňuje odstranit sekvenci maturované miR-155 v genomu leukemických B-buněk. K přenosu plasmidu CRISPR/Cas9 byla využita metoda nukleofekce. K identifikaci buněčných klonů s úspěšnou transfekcí plasmidu CRISPR/Cas9 došlo pomocí FACS a míra exprese jednotlivých genů byla měřena pomocí...
|
|
|
CRISPR/Cas9 editing of leukemic B-cells: searching for microRNA-155 targets involved in the process of leukemogenesis
Sypecká, Markéta ; Savvulidi Vargová, Karina (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Editace leukemických B-buněk pomocí CRISPR/Cas9: hledání cílů miR-155 účastnících se procesu leukemogeneze Úvod: Chronická lymfocytární leukémie (chronická lymfoidní leukémie, CLL) je monoklonální porucha charakterizovaná postupnou akumulací funkčně nekompetentních B- lymfocytů. CLL je nejběžnější formou leukémie u dospělých v západních zemích. Průběh onemocnění se může lišit: někteří pacienti umírají rychle, během 2-3 let od diagnózy, převážně kvůli komplikacím z CLL, ale většina pacientů žije 5-10 let. S progresi nemoci stoupá exprese miR-155, která je označována jako oncomiR. MikroRNA (miRNA) představují negativní regulátory genové exprese. MiR-155 ovlivňuje geny, které se účastní leukemogeneze a buněčného cyklu. A je známo, že miR-155 (podobne jako i jiné miRNA) potlačuje své cíle. Předpokládali jsme, že úpravou genů v CLL bunkách odblokujeme cíle miR-155 a zjistíme korelaci mezi těmito cíli (známými a neznámými) s leukemogenezí CLL. Metody: Metodu, kterou jsme použili pro editaci genů, je CRISPR / Cas9, která umožňuje odstranit sekvenci maturované miR-155 v genomu leukemických B-buněk.K přenosu plasmidu CRISPR/Cas9 byla využita metoda nukleofekce. K identifikaci buněčných klonů s úspěšnou transfekcí plasmidu CRISPR/Cas9 došlo pomocí FACS a míra exprese jednotlivých genů byla měřena pomocí...
|
|
|
Úloha metabolismu fibroblastů plicní adventicie v aktivaci imunitního systému během vývoje plicní arteriální hypertenze
Křivonosková, Monika ; Plecitá, Lydie (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Vznik zánětu v malých distálních plicních cévách je důležitý pro rozvoj plicní arteriální hypertenze (PAH). Jedním z buněčných typů, které se vyskytují v plicní cévě, jsou fibroblasty, jež podle teorie "outside-in" mohou jako první reagovat na podněty v cévě, modulovat přestavbu v plicní cévě směrem k vnitřním vrstvám cévy a lákat do místa další imunitní buňky. Kromě zánětu se v buňkách cév postižených PAH uplatňuje tzv. Warburgův efekt, během kterého dochází ke změnám metabolismu směrem ke glykolýze a laktátové produkci. Mimo jiné dochází k navození prooxidačního stavu uvnitř buňky díky mitochondriálnímu metabolismu a NADPH oxidáze zahrnující nerovnováhu v produkci reaktivních kyslíkových forem. Proto jsme se rozhodli ověřit, zda plicní fibroblasty z telat nemocných hypoxií navozenou PAH mají aktivní inflamazóm, pomocí kterého by produkovaly zralý interleukin 1β (IL-1β) a jaký vliv na tuto expresi má prooxidační prostředí. V našem in vitro modelu jsme potvrdili expresi mRNA IL-1β, ale nebyli jsme schopni detekovat jeho expresi na úrovni proteinu. To odpovídalo i nemožnosti detekce aktivity inflamazómu. Myslíme si, že neschopnost detekce IL-1β proteinu a aktivity inflamazómu je dána citlivostí detekčních metod nebo neschopností plicních fibroblastů z PAH telat aktivovat inflamazóm v in vitro...
|
|
|
Studying immune system using MHC II/ EGFP knock-in mouse
Zadražil, Zdeněk ; Černý, Jan (vedoucí práce) ; Tlaskalová - Hogenová, Helena (oponent)
Imunitní systém je nezbytný pro udržení integrity mnohobuněčných organismů. Podařilo se nám udělat krok vpřed při studiu komplexních imunitních reakcí in vivo/in situ u savců, použitím hlavního histokompatibilního kompexu (MHC) třídy II/ EGFP knock-in myšího modelu. Vzhledem k vizualizaci buněk exprimujících MHC II jsme byli schopni jednoduše pozorovat antigen prezentující buňky (APC), které jsou nezbytné pro nástup imunitní reakce, v jejich přirozeném prostředí organismu. Díky tomu v této práci popisujeme některé dosud nepopsané prvky imunitního systému. Identifikovali jsme uskupení MHC II+ buněk na střevě s neznámou, pravděpodobně unikátní funkcí. Popsali jsme migraci MHC II+ buněk do laktující mléčné žlázy a otestovali několik hypotéz o roli tohoto jevu pro rozvoj mléčné žlázy, produkci mléka a dopadu na vznikající imunitní systém kojence. V neposlední řadě jsme pozorovali residentní makrofágy v rohovce. Charakteristika APC v rohovce je rozporuplné téma, vzhledem k tomu, že rohovka je imunologicky privilegovaná tkáň a proto zde dochází k odlišným imunitním reakcím než ve zbytku organismu. klíčová slova: antigen presentující buňky (APC), hlavní histokompatibilní komplex třídy II (MHC II), EGFP, imunitní systém, knock-in myší model
|
|
|
Cytokiny v efektorové funkci regulačních T lymfocytů
Zadražil, Zdeněk ; Holáň, Vladimír (vedoucí práce) ; Stříž, Ilja (oponent)
Regulační T lymfocyty (Treg) jsou důležitou regulační částí IS (IS). Jejich působením nedochází k nadměrné aktivaci Tef nebo napadání vlastních tkání organismu autoreaktivními buňkami. Treg se vyznačují expresí CD4, transkripčního faktoru Fork box protein 3 (FoxP3) a vysokou expresí CD25. Existují dvě základní populace, a to přirozené Treg (nTreg) vyvíjející se v thymu a indukované (iTreg), které jsou indukovány z naivních CD4+ T lymfocytů, ze kterých také vznikají pomocné T lymfocyty. Přes probíhající intenzivní výzkum regulačních buněk stále není jasné, jakými mechanismy působí. Při prvotních in vitro pokusech bylo ukázáno, že hlavní roli hrají mechanismy, které působí přímým kontaktem mezi regulačními a efektorovými lymfocyty. Ovšem při in vivo experimentech se hlavním účinným mechanismem regulačních buněk ukázaly sekretované rozpustné cytokiny, jako interleukin (IL)-10, IL-35 nebo transformující růstový faktor beta (TGF-β). Od prvotních pokusů bylo objeveno několik dalších mechanismů, které se zdají být důležité vždy jen v určitých situacích nebo při použití specifických buněk či experimentálních modelů. Důvody rozporů mezi in vivo a in vitro výsledky nejsou stále známy. Vzhledem k až doposud objevenému množství různých mechanismů působení Treg je pravděpodobné, že neexistuje určitý hlavní...
|
|
|
Regulace tvorby kostní tkáně pomocí osteogenních suplementů v modelu osteoporózy
Krčmářová, Eliška ; Filová, Eva (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Osteoporóza je onemocnění kostního metabolismu charakteristické úbytkem kostní hmoty. Příčinou tohoto onemocnění je dysbalance mezi tvorbou nové kostní hmoty osteoblasty a resorpcí kostní tkáně osteoklasty, ve prospěch kostní resorpce. Rizikovou skupinou p tohoto onemocnění jsou ženy po menopauze, u kterých v tomto období přirozeně dochází poklesu hormonu estrogenu. Estrogen působí jako inhibitor proosteoklastových faktorů, ligand vážící se na receptor aktivující jaderný faktor κB faktor nádorové nekrózy α. Nerovnováha kostního metabolismu může být mimo jiné zapříčiněna i dysbalancí v produkci Prostaglandinu E2 (PGE2) a 1α,25 . Jedná se o silné mediátory, které mohou stimulo závislosti na podmínkách kultury/ko této práci byl přezkoumán vliv těchto mediátorů (PGE2 v 1α,25 otkaních mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) v přítomnosti osteoblastů, bez nebo s kombinací proosteoklastových ů stimulující kolonie makrofágů Osteoklastogeneze byla stimulována, pokud byly PGE2 a 1α,25 kombinovány s výjimkou PGE2 10 M, který vykazoval inhibiční efekt. Přidávání pouze PGE2 nebo 1α,25 nebylo dostatečné pro iniciaci osteoklastogeneze. Potenciál osteoklastogeneze byl sledován i u buněk izolovaných z potkanů s indukovanou osteoporózou pomocí ovariektomie. PBMC izolované z těchto jedinců ukázaly schopnost diferenciace v...
|
|
|
Optimalizace CAR T lymfocytů pro imunoterapii hematologických malignit
Mucha, Martin ; Otáhal, Pavel (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Imunoterapie založená na T lymfocytech exprimujících chimerické antigenní receptory (CAR) se ukázala být velice úspěšnou v léčbě akutní lymfoblastické leukémie (ALL), což vedlo ke snaze vyvinout imunoterapeutické postupy založené na CAR T lymfocytech i pro další hematologické malignity. V současné době je snaha vylepšit modifikace T lymfocytů tak, aby léčba pacientů byla efektivnější. Pokaždé je pak třeba tuto modifikaci empiricky ověřit v pokusech in vitro. Rozhodli jsme se studovat efekt cytokinu IL-21 na protinádorovou funkci CD19 specifických CAR T lymfocytů pomocí in vitro testů. Do T buněk byl vnesen konstrukt, který koexprimoval IL-21 pod kontrolou inducibilního NFAT promotoru společně s CAR proti CD19. V sérii experimentů byly porovnávány vlastnosti těchto buněk po kokultivaci s nádorovými B buněčnými liniemi a buňkami CLL získané od pacientů. Z výsledků vyplývá, že CAR T buňky, které exprimují IL-21, lépe proliferují a lépe se aktivují, a to i po opakované stimulaci leukemickými buňkami. Kromě CARů specifických proti molekule CD19 jsme se zabývali i CARy specifickýmiproti molekule CLL1, která je v literatuře popisována jako jeden ze slibných targetů pro léčbu AML. Připravili jsme CAR T buňky proti CLL1 produkující IL-21. Pro tento účel bylo třeba připravit plazmid, který kromě sekvence pro...
|
|
|
Identification of novel mechanisms controlling emergency granulopoiesis in hematopoietic stem and progenitor cells
Vaníčková, Karolína ; Alberich Jorda, Meritxell (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Granulocyty představují první linii obrany proti bakteriálním a houbovým patogenům. Zatímco bazální granulopoéza zajišťuje každodenní produkci granulocytů, ve stresových podmínkách, jako je bakteriální infekce, je zvýšená a urychlená produkce granulocytů zajišťována pohotovostní granulopoézou (PG). Velmi málo se ví o tom, jak je PG regulovaná. V této práci jsme ukázali, že signalizační dráha Wnt/β-katenin je zásadní pro aktivaci PG in vivo. Dále jsme ukázali, že stimulace pomocí lipopolysacharidu (LPS) aktivuje akumulaci aktivního -kateninu v hematopoetických kmenových a progenitorových buňkách (HKPB) již po 4 hodinách (H), největší nárůst jsme pozorovali 24H po stimulaci. Tuto aktivaci jsme pozorovali také in vitro, již 2H po LPS stimulaci c-Kit+ buněk, s největším nárůstem 4H po stimulaci. To dokazuje, že aktivace β-kateninu je alespoň částečně nezávislá na mikroprostředí kostní dřeně. Pomocí single cell RNA sekvenování jsme analyzovali dynamiku jednotlivých sub-populací HKPB 4H po LPS stimulaci. V jedné z populací jsme identifikovali možný aktivátor -kateninové signalizace - Wnt10b. Nárůst exprese Wnt10b jsme detekovali také při in vitro LPS stimulacích. Tento nárůst koreloval s aktivací -kateninu a nárůstem exprese Cebpb, hlavního regulátoru pohotovostní granulopoézy. Naše data tak ukazují...
|
|
|
Effect of gluten-free diet on potentially regulatory immune mechanisms in human type 1 diabetes
Císařová, Radka ; Funda, David (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Diabetes 1. typu (T1D, type 1 diabetes) je autoimunitní onemocnění, jehož incidence vzrůstá každý rok, a prevence nebo léčba této nemoci neexistuje. T1D je ovlivňován mnoha genetickými faktory, nicméně environmentální faktory představují hlavní důvod pro současný prudký, až téměř epidemický, celosvětový nárůst T1D, především pak ve vyspělých zemích. Mezi tyto faktory patří například enterovirové infekce, dysbióza mikrobiomu nebo bezlepková dieta (GFD, gluten-free diet). Bezlepková dieta má protektivní efekt u NOD myší, které jsou spontánním modelem T1D, a prospěšný vliv na kontrolu glykémie u lidí, pokud je dodržována po diagnóze T1D. Tato diplomová práce zkoumala změny regulačních a potenciálně regulačních buněk a jejich cytokinů v mononukleárních buňkách periferní krve (PBMC, peripheral blood mononuclear cells) u dětí s T1D, které se zúčastnily 12 měsíční intervenční studie ohledně GFD. Dále se práce zabývala zkoumáním, zda lze vliv GFD na regulační funkce imunitního systému přenést do bezmikrobního NOD myšího modelu pomocí jejich kolonizace mikrobiomem od T1D dětí. Zjistili jsme, že GFD zvýšila procenta Tr1 buněk a IL-10 produkujících CD4+ T-buněk v periferní krvi dětí s T1D. Dále se zdá, že prospěšný vliv GFD může být alespoň částečně přenesen do NOD myší pomocí mikrobiomu, protože myši, které...
|
host ::
RSS.