|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
|
|
Zastoupení komponent ATP synthasomu v různých tkáních potkana a u pacientů s defektem ATP synthasy
Mikulová, Tereza ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent)
Komplexy oxidační fosforylace (OXPHOS) vytváří v rámci vnitřní mitochondriální membrány vyšší strukturní a funkční celky, tzv. superkomplexy, které umožňují cílené směrování substrátu z jednoho komplexu na druhý. I ATP synthasa je schopna organizovat se do komplexnějších struktur. V savčích mitochondriích se běžně vyskytuje v dimerní podobě, existují důkazy o její trimerizaci a dokonce i tetramerním uspořádání. Ukazuje se, že dochází i k vzájemnému propojení komponent mitochondriálního fosforylačního aparátu tvořeného ATP synthasou katalyzující fosforylaci ADP na ATP, přenašečem adeninových nukleotidů (ANT) zabezpečujícím výměnu nasyntetizovaného ATP za ADP přes vnitřní mitochondriální membránu a fosfátovým translokátorem (PiC), který umožňuje import anorganického fosfátu (Pi) do matrix mitochondrie. Tyto komponenty by mohly vytvářet superkomplex, tzv. ATP synthasom, který by zvyšoval efektivitu jednotlivých procesů vedoucích k tvorbě ATP. V této práci byly nejprve sledovány obsahy složek fosforylačního aparátu v souvislosti s rozdílným obsahem ATP synthasy v mitochondriích izolovaných celkem z devíti tkání potkana. Proteiny z izolovaných mitochondrií byly separovány pomocí elektroforéz za denaturujících podmínek (SDS-PAGE) a jejich množství byla analyzována specifickými protilátkami. Podle...
|
|
|
Biosurfaktanty a jejich využití pro inkorporaci hydrofobních domén do moderních nosičových systémů
Nešpor, Tomáš ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá aktuálním tématem nosičových systémů. Jelikož největším problémem je prostup hydrofobních léčivých látek krevním řečištěm, případně přes univerzální tělní bariéry (např. hematoencefalická) je nutné tyto nosiče chemicky modifikovat, aby bylo možné hydrofobní látky efektivně podávat. V práci je na základě literární rešerše navrženo a následně studováno hned několik systémů, u kterých je předpoklad možného použití pro nosičové systémy a zároveň v sobě mají zakomponované biosurfaktanty z důvodu jejich schopnosti solubilizovat hydrofobní molekuly. V teoretické části této práce budou popsány jednotlivé biosurfaktanty, postup jejich produkce, jejich fyzikálně-chemické vlastnosti a možnost jejich využití v nosičových systémech. Zároveň jsou popsány jednotlivé nosičové systémy, postup jejich přípravy, možnosti jejich využití a jsou také srovnány jejich přednosti a nevýhody. V praktické části je poté proveden screening jak jednotlivých látek a jejich vzájemných interakcí, tak metod využitelných ke studiu vznikajících struktur. Studium molekulárních interakcí je primárně prováděno pomocí techniky dynamického rozptylu světla. V další části je popsána optimalizace tvorby hydrogelů se zakomponovanými biosurfaktanty v jejich struktuře a následně jsou vytvořené gely podrobeny reologickým a solubilizačním testům. Studium vnitřní struktury těchto gelů je provedeno pomocí skenovacího elektronového mikroskopu.
|
|
|
Solubilizace v systémech kataniontových tenzidů
Konečná, Anna ; Krouská, Jitka (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá solubilizací hydrofobních barviv v systémech kladně nabitých kataniontových vezikul. Cílem práce bylo stanovení jejich solubilizační kapacity. Vezikulární systémy byly připraveny z opačně nabitých povrchově aktivních látek CTAB a SDS. Pro zvýšení stability vezikul byl do jejich struktury přidán cholesterol a kladně nabitý dvouřetězcový tenzid DODAC, díky kterému systém získal kladný náboj. Pro stanovení solubilizační kapacity byla použita barviva 1-Naftol, Sudan Red G a Oil Red O a byly použity dva způsoby přípravy vzorků, tzv. spontánní a přímá solubilizace. Měření bylo provedeno po 1, 2, 3 a 7 dnech od přípravy vzorků pomocí UV-VIS spektrofotometrie, kdy byla měřena absorbance, ze které byla následně výpočtem z kalibračních křivek stanovena solubilizační kapacita. Výsledky ukazují, že přímá solubilizace je mírně účinnější než solubilizace spontánní. Ze zvolených barviv se nejlépe solubilizoval 1-Naftol, tedy látka s nejmenší molekulou, kdy pravděpodobně došlo k jeho 100% solubilizaci do systému vezikul.
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidské NADPH: cytochrom P450 oxidoreduktasy
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
NADPH: cytochrom P450 oxidoreduktasa (POR) je nezbytnou složkou řady metabolických procesů, kde vystupuje jako přenašeč redukčních ekvivalentů mezi NADPH a redoxním partnerem. K takovým procesům patří i katalytické reakce cytochromů P450, které se markantně podílejí na metabolismu steroidních hormonů, léčiv a xenobiotik. Obzvláště pak mikrosomální cytochromy P450 jsou striktně závislé na elektronové podpoře ze strany POR a společně vytvářejí systém oxygenas se smíšenou funkcí. Mutace v proteinové struktuře POR mohou doléhat na aktivitu jeho redoxních partnerů a některé polymorfismy POR mohou vést až k vážným poruchám, většinou spojených s defektním metabolismem steroidů. V této práci byla připravena POR nesoucí dvojí mutaci A503V a P228L. Doposud však nebylo prokázáno, že by byl tento polymorfismus asociován s jakýmkoli neobvyklým vývojovým fenotypem či poruchou, které by měly devastující účinky na lidský organismus. Nicméně při některých metabolických studiích se hodnoty aktivity A503V odlišují od hodnot stanovených pro wild-type formu POR. V rámci této diplomové práce byly připraveny konstrukty rekombinantní plasmidové DNA nesoucí gen pro lidskou POR nebo gen pro lidskou POR s histidinovou kotvou. Oba konstrukty byly založeny na expresním vektoru pCW. Rekombinantní POR bez histidinové kotvy byla...
|
|
|
Hydrosolubilization of BODIPY for optical labelling of biomolecules
Bartoň, Jan ; Kotek, Jan (vedoucí práce) ; Vrábel, Milan (oponent)
1 Abstrakt Cílem této práce bylo ukázat syntézu a potenciální využití fluorescenčních sond rozpustných ve vodě založených na BODIPY. Konkrétně se jednalo o přípravu sond s mono- a heterobi- funkčními funkčními skupinami. Bylo nezbytné optimalizovat podmínky pro spolehlivou, škálo- vatelnou a rychlou sulfonaci BODIPY v polohách 2,6. Dále byl vytvořen postup pro práci se sulfonovaným BODIPY, především výměnu protiiontů. Při výběru protiiontů byla uvažována jejich biokompatibilita, reakční cesta při syntéze a separace produktů. Ve druhé části práce byla připravena série ve vodě rozpustných fluorescenčních sond, do kterých lze snadno zavést bioaktivní nebo bioortogonální funkční skupiny. Takto modifikované sondy lze využít v klik chemii ve spojení s off/on sondou nebo pro fluorescenční detekci molekul či iontů. Zásadní je, že navržené aplikace lze provádět ve vodných roztocích bez použití orga- nických rozpouštědel, což je nezbytné pro biochemické, analytické a zobrazovací uplatnění. Klíčová slova BODIPY, bifunkční, rozpustná ve vodě, fluorescenční sonda, solubilizace, biokompatibilní sonda, bioortogonální reakce, sulfonace BODIPY
|
|
| |
|
|
Bifunkční BODIPY pro optické značení biomolekul
Bartoň, Jan ; Kotek, Jan (vedoucí práce) ; Henke, Petr (oponent)
V této práci byl připraven ve vodě rozpustný derivát BODIPY s aktivní skupinou umožňující připojení dalších skupin. Cílová aplikace tohoto bifunkčního bioortogonálního derivátu BO- DIPY je fluorescenční značení biomolekul využitelné v molekulární biologii a biochemii. Hlavní náplní této práce byla optimalizace syntézy BODIPY jádra a sulfonace BODIPY v polohách 2,6. Bylo zjištěno, že sodná sůl sulfonovaného BODIPY je nevhodná pro další deriva- tizaci BODIPY z důvodu omezené rozpustnosti v méně polárních rozpouštědlech než methanol. Na základě tohoto zjištění byla připravena ethyldiisopropylamonná sůl sulfonovaného BODIPY, která je velmi dobře rozpustná v polárních i nepolárních rozpouštědlech. Tyto poznatky budou využity při syntéze bifunkčního ve vodě rozpustného derivátu BODIPY. Byl potvrzen potenciál palladnatého komplexu BODIPY pro detekci CO. Klíčová slova BODIPY, bifunkční, rozpustné ve vodě, fluorescenční sonda, fluorescence, značení proteinů, solubilizace
|
|
|
Uvolňování solubilizovaných látek z fázově separovaných hydrogelů
Havlíková, Martina ; Krouská, Jitka (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá uvolňováním solubilizovaných látek z fázově separovaných hydrogelů. Cílem práce je stanovit jejich solubilizační kapacitu. Hydrogely byly připraveny na základě interakce záporně nabitého polymeru (hyaluronan) a kladně nabitého tenzidu (Septonex) a byly připraveny dvěma možnými způsoby, tzv. „mokrou“ a „suchou cestou“. K solubilizačním experimentům byl použit fluorescein a akridinová oranž, jakožto fluorescenční sondy. K určení, zda se z hydrogelu dané látky uvolňují nebo ne, byla primárně použita metoda UV-VIS spektrofotometrie, kdy jednotlivá měření probíhala po 24, 48 a 72 hodinách od doby jejich přípravy. Tato metoda se ale později ukázala jako nevhodná a nepřesná z důvodů vzniku zakalených supernatantů nad vzniklými gely a nízkých koncentrací fluorescenčních sond v tomto roztoku. Z těchto důvodů byla zvolena metoda měření na základě fluorescence těchto sond pomocí přístroje MicroTime 200. Jedná se o velice přesný přístroj, proto výsledky z tohoto měření byly brány jako relevantní. Výsledky byly shrnuty na základě použití fluorescenčních sond, kdy bylo prokázáno, že fluorescein jako záporně nabitá molekula se uvolňuje podstatně méně než akridinová oranž.
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
host ::
RSS.