|
|
Enzymová syntéza a studium vlastností DNA modifikovaných na bázích
Viktorinová, Klára ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Vrábel, Milan (oponent)
Vliv a specifické interakce chemických modifikací ve velkém žlábku DNA jsou dlouhodobě a systematicky zkoumány. Tato práce se zabývá enzymovou přípravou DNA nesoucí fenylové substituenty na bázích v miligramovém množství. K této syntéze jsou potřeba čtyři 2'-deoxyribonukleosid trifosfáty nesoucí elektronově bohatou fenylovou skupinu v pozici 7 u 7-deazapurinů a v pozici 5 u pyrimidinů (dAPhTP, dGPhTP, dCPhTP, dUPhTP), které byly připraveny ve skupině prof. Hocka. Pro uskutečnění enzymové syntézy byla použita DNA polymerasa KOD(exo-), která byla pro účely této práce exprimována. Všechny čtyři modifikované 2'-deoxyribonukleosid trifosfáty nesoucí fenylovou skupinu byly úspěšně inkorporovány do oligonukleotidového řetězce metodou extenze primeru a DNA byla syntetizována v miligramovém měřítku. Jednotlivé produkty byly čištěny pomocí dialýzy a HPLC. Dále byla sledována jejich teplota denaturace na UV-Vis spektrofotometru a jejich struktura spektroskopickou metodou CD. Hlavním cílem těchto a budoucích studií je zejména pochopení různých biologických procesů a bioortogonálních reakcí makromolekul. Klíčová slova DNA, modifikace, oligonukleotidy, polymerasy, PEX, PCR, strukturní analýza, CD
|
|
|
Photoaffinitive conjugation of biomolecules
Masárová, Petra ; Slanina, Tomáš (vedoucí práce) ; Vrábel, Milan (oponent)
Foto-click chémia zahŕňa skupinu foto-aktivovateľných click reakcií, ktoré sú význačné presnou priestorovou a časovou kontrolou, vysokou selektivitou a kvantitativnými výťažkami. Táto práca sa zameria na niekoľko hlavných tried svetlom kontrolovaných reakcií a pokúsi sa popísať ich chémiu v reverzibilných (nukleofilných) a ireverzibilných (cykloadičných a Diels- Alderových) reakciách iniciovaných po ožiarení fotoaktívneho prekurzoru. Derivatizáciou fotoaktívnych prekurzorov je možné posunúť absorpciu látky do viditelného spektra a teda uskutočniť nedeštruktívnu excitáciu in vivo, čo ponúka značný potenciál v biologicky zameranom výskume. Význam click fotochémie spočíva v neobyčajnej selektivite, ktorá umožňuje, aby reakcie prebiehali v komplexných, nekontrolovaných biologických prostrediach. Foto-aktivovateľné prekurzory je možné konjugovať s biologicky významnými skupinami, čo predstavuje metódu častokrát využívanú vo fotoafinitnom značení. Reaktivita fotoaktívnych substrátov voči biologickým nukleofilom bola skúmaná v rôznorodých oblastiach aplikovaného výskumu - popis a diskusia recentného úsilia bude taktiež témou tejto práce.
|
|
|
Modified nucleotides and DNA for electrochemical labelling and defined display of small molecules
Krömer, Matouš ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Křen, Vladimír (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
Souhrn Tato práce je zaměřena na enzymatickou syntézu sond pro elektrochemické značení, biokonjugace a ve své závěrečné kapitole, postavené na poznatcích získaných v předchozích částech, popisuje metodu pro přípravu vysoce funkcionalizované DNA modifikované na bázích, využitelnou pro kontrolovanou multivalentní prezentaci glykosidů. V první částí byla nalezena metoda pro přípravu nukleotidů nesoucích diolové skupiny. Sonogashirova reakce umožnila přístup k diolům připojeným přes alkynovou spojku, následná katalytická hydrogenace, poprvé popsána v literatuře, poté poskytla cestu k diolům připojeným přes flexibilní sp3 hybridizovanou spojku, a to bez použití chránících skupin. Štěpení diolů připojených k nukleotidům přes sp3 spojku, nikoliv však přes alkynovou spojku, vedlo ke vzniku nukleotidu modifikovaného alifatickým aldehydem. Všechny nukleotidy byly dobrými substráty pro KOD XL DNA polymerázu, jak v reakci extenze primeru, tak v polymerázové řetězové reakci, vyjma aldehydem modifikovaného dUTP, který byl akceptován v PEX, ale produkty PCR reakce vznikaly pouze ve směsích s přirozeným dTTP. Toto omezení bylo překonáno štěpením diolů až po inkorporaci do DNA, čímž také vznikla DNA modifikovaná aldehydovými skupinami. Všechny reaktivní sondy byly použiti pro biokonjugace s fluorescenčním hydrazeinem, pro...
|
|
|
Bioorthogonal reactions on DNA for regulation of transcription
Chakrapani, Aswathi ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Zimčík, Petr (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
Souhrn Tato disertační práce popisuje návrh a syntézu derivátů nukleotidů a DNA nesoucích fotolabilní nebo glukosylované modifikace připojené k epigenetické značce 5-(hydroxymethyl)pyrimidinu, pomocí chemických a enzymatických metod a dále studium regulace genové exprese na bakteriální (Escherichia coli RNA polymeráza) in vitro transkripční úrovni. V první části práce je popsán design a syntéza 5-nitrobenzyloxymethyl-2'-deoxyuridinových (dUNB) a -cytidinových (dCNB) fosforamiditů. Tyto nukleosidové fosforamiditové stavební bloky chráněné fotolabilní skupinou byly použity při automatizované syntéze oligonukleotidů (ONs) na pevné fázi modifikovaných ve specifických polohách. ONs byly následně použity jako přímé primery v polymerázové řetězové reakci (PCR) pro konstrukci dUNB- a dCNB-modifikovaných DNA templátů v konkrétních pozicích promotorové oblasti. Značená DNA byla poté v této oblasti ozářena světlem, které způsobilo uvolnění NB-skupin a vedlo ke vzniku odpovídajících specifických míst nesoucích volnou 5-(hydroxymethyl)ovou (5hm) modifikaci. Následně byly provedeny bakteriální in vitro transkripční studie modifikované i přirozené DNA. Inkorporace epigenetických pyrimidinových nukleotidů dUNB a dCNB nesoucích fotosenzitivní chránící skupiny do promotorové oblasti (-35) templátové DNA vedla k částečné...
|
|
|
Modifications of DNA by reactive groups for bioconjugations and cross-links with arginine-containing peptides and proteins
Leone, Denise Liu ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Urban, Milan (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
SOUHRN Tato disertační práce popisuje vývoj a syntézu DNA-reaktivních vláken nesoucích 1,3-diketonové nebo fenylglyoxalové části, které lze použít pro spojování s peptidy nebo proteiny obsahujícími arginin. Obecná strategie byla založena na funkcionalizaci polohy 5 u pyrimidinů prostřednictvím vodné Sonogashirovy reakce nebo click reakce (CuAAC) s reaktivními stavebními bloky pro syntézu modifikovaných 2'-deoxyribonukleosid monofosfátů a trifosfátů (dNMP/dNTPs). Následujícím krokem bylo enzymatické začlenění takto funkcionalizovaných dNTPs do DNA prostřednictvím metody prodlužování primeru (PEX). Paralelně byly monofosfátové deriváty použity jako modelové sloučeniny pro reakce s argininem a peptidy obsahujícími arginin pro testování reaktivity na vláknech DNA. Pro reaktivní kandidáty byly provedeny modelové reakce na modifikované DNA s argininem nebo peptidy obsahujícími Arg a následně byly DNA vlákna použity v reakcích s DNA-vazebnými proteiny bohatými na Arg. Vývoj takových vláken DNA nebyl přímočarý, ale vyžadoval zkoumání různých kandidátů. Nejdůležitějším bodem a zároveň výzvou při návrhu reaktivních stavebních bloků bylo nalezení rovnováhy mezi reaktivitou a stabilitou reaktivní skupiny. Prvním kandidátem byla glyoxylamidová skupina maskovaná thiazolidinem. Bohužel se ukázalo, že tento kandidát je...
|
|
|
Design and Synthesis of cell nucleus-targeted compounds for use in bioorthogonal reactions
Hrušák, Jáchym ; Vrábel, Milan (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent)
Tato bakalářská práce se soustředí na návrh a syntézu 1,2,4,5-tetrazinových a trans- -cyklooktenových derivátů s funkčními skupinami schopnými cílit na buněčné jádro a účastnit se bioortogonálních reakcí. Na základě literární rešerše byly navrženy funkční skupiny a struktura tetrazinových a trans-cyklooktenových derivátů tak, aby bylo dosaženo selektivního cílení do jádra buněk a aby byla zajištěna dostatečná reaktivita výsledných konjugátů v biologickém prostředí. Takto navržené látky byly syntetizovány a v modelových systémech byly zkoumány jejich vlastnosti a reaktivita.
|
|
|
Hydrosolubilization of BODIPY for optical labelling of biomolecules
Bartoň, Jan ; Kotek, Jan (vedoucí práce) ; Vrábel, Milan (oponent)
1 Abstrakt Cílem této práce bylo ukázat syntézu a potenciální využití fluorescenčních sond rozpustných ve vodě založených na BODIPY. Konkrétně se jednalo o přípravu sond s mono- a heterobi- funkčními funkčními skupinami. Bylo nezbytné optimalizovat podmínky pro spolehlivou, škálo- vatelnou a rychlou sulfonaci BODIPY v polohách 2,6. Dále byl vytvořen postup pro práci se sulfonovaným BODIPY, především výměnu protiiontů. Při výběru protiiontů byla uvažována jejich biokompatibilita, reakční cesta při syntéze a separace produktů. Ve druhé části práce byla připravena série ve vodě rozpustných fluorescenčních sond, do kterých lze snadno zavést bioaktivní nebo bioortogonální funkční skupiny. Takto modifikované sondy lze využít v klik chemii ve spojení s off/on sondou nebo pro fluorescenční detekci molekul či iontů. Zásadní je, že navržené aplikace lze provádět ve vodných roztocích bez použití orga- nických rozpouštědel, což je nezbytné pro biochemické, analytické a zobrazovací uplatnění. Klíčová slova BODIPY, bifunkční, rozpustná ve vodě, fluorescenční sonda, solubilizace, biokompatibilní sonda, bioortogonální reakce, sulfonace BODIPY
|
|
|
Redox labelling of nucleic acids for analyzing nucleotide sequences and monitoring DNA-protein interactions
Fojta, Miroslav ; Havran, Luděk ; Horáková Brázdilová, Petra ; Pivoňková, Hana ; Kostečka, Pavel ; Macíčková-Cahová, Hana ; Raindlová, Veronika ; Vrábel, Milan ; Hocek, Michal
Nucleobase labelling of DNA for electrochemical sensing was attained through chemical modification of thymine bases with osmium tetroxide in the presence of nitrogenous ligands, or via enzymatic incorporation of nucleotide conjugates with redox-active moieties using labelled deoxynucleoside triphosphates. DNA hybridization, primer extension and PCR techniques were used for sequence-specific DNA assays. Tail-labelled DNA substrates were applied to monitor DNA binding by tumour suppressor p53 protein.
|
|
|
Příprava modifikovaných nukleosidů, nukleotidů a oligonukleotidů nesoucích komplexy kovů
Vrábel, Milan ; Hocek, Michal
Byla připravena série modifikovaných nucleosidů a oligonukleotidů nesoucích komplexy kovů. Paládiem katalyzované cross-coupling reakce byly klíčovým krokem při syntéze modifikovaných kovem-značených nukleosidů, nukleotidů a oligonukleotidů. Příslušné Fc modifikované nukleosid trifosfáty byly dobrými substráty DNA polymeráz a byly úspěšně zabudovány do DNA pomocí primer extenze (PEX). Takto modifikované nukleové kyseliny jsou použitelné jako nástroje pro bioanalýzu.
|
|
| |
host ::
RSS.