|
|
Oxidace ellipticinu lidskými cytochromy P450 exprimovanými v prokaryotním a eukaryotním systému
Vejvodová, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Ellipticin, protinádorový alkaloid, představuje léčivo, jehož mechanismus účinku je založen na interkalaci do DNA, inhibici topoisomerasy II a na tvorbě kovalentních aduktů s DNA prostřednictvím enzymové aktivace cytochromy P450 a/nebo peroxidasami. Ellipticin je oxidován cytochromy P450 až na pět metabolitů (7-hydroxy-, 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu). Z těchto metabolitů jsou 9-hydroxy- a 7- hydroxyellipticin považovány za detoxikační metabolity, zatímco 12-hydroxyellipticin, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu za aktivační metabolity, které jsou zodpovědné za tvorbu kovalentních aduktů s DNA. V diplomové práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotním (SupersomesTM ) a dvou prokaryotních expresních systémech (Bactosomes) v oxidaci ellipticinu. Cytochromy P450 exprimované v prokaryotních systémech se lišily v množství "koexprimované" NADPH:CYP reduktasy. Vzniklé metabolity ellipticinu byly analyzovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské cytochromy P450 CYP2C9/2D6/2C19 exprimované v prokaryotním nebo eukaryotním systému oxidují ellipticin za vzniku až čtyř metabolitů: 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13-hydroxyellipticinu and N2 -oxid ellipticinu. Jejich účinnost se ale...
|
|
|
Modelování interakcí cytochromů P450 s flavodoxinem
Culka, Martin ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Cytochromy P450 jsou různorodá skupina hemových enzymů vyskytujících se u vět- šiny organismů na Zemi. U lidí zasahují např. do metabolismu cizorodých látek, bakterie jsou schopné díky nim metabolizovat různé hydrofobní substráty. Obecnou reakcí kata- lyzovanou cytochromy P450 je monooxygenace, tedy vnesení jednoho atomu z molekuly kyslíku do substrátu a redukce druhého za vzniku vody. Pro redukci kyslíku je třeba dodávat elektrony, jako donor elektronů u eukaryot obvykle slouží NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa či cytochrom b5, u bakterií však donorem elektronů bývají malé FeS proteiny a flavoproteiny Již dříve bylo ukázáno, že bakteriální donor elektronů fla- vodoxin je schopen dodávat elektrony některým lidským cytochromům P450 in vitro. V této práci jsem se snažil ověřit hypotézu, že flavodoxin je zodpovědný za redukci vybraných lidských (1A2, 2A6, 2A13, 2C9, 2C19, 3A4) a bakteriálních (101A1 a 176A1) cytochromů P450 heterologně exprimovaných v buňkách Escherichia coli. Ke studiu byly použity techniky molekulového modelování. Byla navržena sada možných orientací komplexu jednotlivých cytochromů P450 s flavodoxinem metodou řízeného "dockingu a následně byla ověřena stabilita těchto komplexů řízenou disociací. Byly vybrány nejstabilnější orientace pro každý cytochrom P450, ty byly dále optimalizovány...
|
|
|
Interakce vybraných flavonoidů s cytochromy P450 rodiny 2B
Boštíková, Zdislava ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
V současnosti je kladen větší důraz na zdravý životní styl, který zahrnuje mimo jiné i konzumaci přírodních látek ve formě potravních doplňků. Tyto sloučeniny, často flavonoidního charakteru, vykazují různé chemopreventivní účinky, například antioxidační či proti-karcinogenní účinky. Jejich nadměrná konzumace však může mít i negativní dopad na lidské zdraví. Flavonoidy mohou například ovlivňovat koncentraci biotransformačních enzymů cytochromů P450 v buňkách a tím zasahovat do metabolismu cizorodých látek. Takový zásah by pro člověka mohl mít za následek rozvoj karcinogeneze či neúčinnost některých léčiv. Tato bakalářská práce se zabývá studiem schopností dvou flavonoidních sloučenin myricetinu a dihydromyricetinu indukovat a inhibovat cytochromy P450 rodiny 2B. Pomocí metody Western blotu bylo zjištěno, že ani jeden ze zkoumaných flavonoidů nezvyšuje expresi CYP2B1/2 v játrech, myricetin ani v žádné části tenkého střeva. V případě dihydromyricetinu byla pozorována indukce daných cytochromů P450 rodiny 2B ve střední části tenkého střeva. Inhibiční schopnost flavonoidů byla měřena in vitro jako pokles aktivity CYP2B při O-depentylaci 7-pentoxyresorufinu. Byly zjištěny hodnoty IC50 8,8μM pro myricetin a 0,5mM v případě dihydromyricetinu. Klíčová slova: xenobiotika, cytochromy P450, indukce, metabolismus
|
|
|
Vliv pH na oxidaci vandetanibu
Fedák, Michal ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Otáhalová, Barbora (oponent)
Vandetanib je protinádorové léčivo využívající se zejména pro cílenou léčbu medulárního karcinomu štítné žlázy. Působí jako inhibitor tyrosinkinas a vyznačuje se selektivitou vůči receptorům vaskulárního endoteliálního růstového faktoru 2 (VEGFR-2), epidermálního růstového faktoru (EGFR) a inhibuje také tyrosinkinasovou aktivitu přesmyku během transfekce (RET). V organizmu lidí a také experimentálních zvířat je vandetanib metabolizován pomocí cytochromů P450 (CYP) a flavinmonooxygenas (FMO). Pomocí CYP je vandetanib oxidován za vzniku N-desmethylvandetanibu. Působením FMO se z vandetanibu tvoří vandetanib N-oxid. V této bakalářské práci byl studován vliv pH na oxidaci vandetanibu pomocí CYP a FMO obsažených v potkaních jaterních mikrosomech indukovaných různými činidly. Získaná data ukazují, že ve většině sérií jsou optimální hodnoty pH oxidace vandetanibu jak pomocí CYP, tak FMO dosti podobné. Největší množství N-desmethylvandetanibu bylo pozorováno hlavně při pH 8,5. Vandetanib N-oxid byl v největší míře tvořen také ve většině sérií při stejné hodnotě pH. Výsledky naznačují, že N-desmethylvandetanib je tvořen v největší míře při hodnotách pH, které nespadají do intervalu pH pro optimální aktivitu CYP. Vysvětlení pro toto zjištění poskytuje zřejmě fakt, že zastoupení vandetanibu v jeho neutrální...
|
|
|
Přeměna cabozantinibu enzymy první fáze biotransformace
Jurečka, Tomáš ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cabozantinib je protinádorové léčivo, které inhibuje tyrosinkinasy zprostředkovávající signalizační dráhy důležité pro růst a vývoj nádorů. Je používán pro léčbu medulárního karcinomu štítné žlázy, hepatocelulárního karcinomu a karcinomu ledvin. Hlavními enzymy první fáze biotransformace, kterými je katalyzována přeměna cabozantinibu, jsou cytochromy P450. V diplomové práci byl studován metabolismus cabozantinibu a cytochromy P450 podílející se na tomto metabolismu. V práci byly pro studium metabolismu cabozantinibu používány jaterní mikrosomy potkana, myši a králíka. Rovněž byl sledován vliv jednotlivých izoforem cytochromů P450 na metabolismus cabozantinibu za použití potkaních mikrosomů. Studována byla také časová závislost přeměny cabozantinibu jaterními mikrosomy potkana. Zahrnuto bylo také studium enzymové kinetiky přeměny cabozantinibu jaterními mikrosomy potkana a studium vlivu inhibitorů cytochromů P450 na tento metabolismus. Metabolity byly analyzovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a hmotnostní spektrometrie. Tvorba metabolitů cabozantinibu rostla s časem inkubace až do 30. minuty, u některých metabolitů až do 40. minuty. Během experimentů bylo detekováno až pět metabolitů cabozantinibu (M1, desmethylcabozantinib, M3, monohydroxycabozantinib a N-oxid cabozantinibu)....
|
|
|
Cílená mutageneze ve studiu lidských cytochromů P450 rodiny 1 a jejich interakčních partnerů
Milichovský, Jan
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
|
|
Mechanismus karcinogenity a nefrotoxicity aristolochových kyselin
Bárta, František
Aristolochové kyseliny (AA) jsou lidskými karcinogeny, které rovněž vykazují silné nefrotoxické vlastnosti. Směs AA je obsažena v rostlinách čeledi podražcovitých (Aristolochiaceae), které byly a nadále jsou užívány v tradiční medicíně, zejména v Asii. Aristolochové kyseliny se podílí na vzniku dvou typů nefropatií. Jedna z nich dokonce nese označení nefropatie vyvolaná aristolochovou kyselinou (Aristolochic Acid Nephropathy, AAN). Druhým onemocněním je balkánská endemická nefropatie (Balkan Endemic Nepropathy, BEN). Obě onemocnění jsou doprovázena malignacemi v urotheliální tkáni, které jsou vyvolány karcinogenním působením AA. Zvláštním znakem AAN a BEN je skutečnost, že ne všichni pacienti vystavení působení AA byli postiženi nefropatií a vývojem nádorového onemocnění. Jednou z příčin této skutečnosti mohou být rozdíly v aktivitách a expresních hladinách enzymů biotransformujících AAI, hlavní toxickou složku obsaženou v rostlinném extraktu. Detailní poznání enzymů podílejících se na metabolismu AAI může přispět k objasnění interindividuální vnímavosti vůči AAN, BEN a malignacím. Aristolochová kyselina I je v organismu buď oxidačně detoxifikována anebo redukčně aktivována. Redukční bioaktivace AAI vede ke tvorbě kovalentních aduktů AA s DNA, které resultují ve vznik unikátní transversní mutace...
|
|
|
Mechanismus působení protinádorového léčiva ellipticinu v cílových tkáních jeho účinku
Mrízová, Iveta
Ellipticin je alkaloid čeledě Apocynaceae, který vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Na metabolismu ellipticinu se podílí cytochromy P450 (CYP) a peroxidasy za vzniku aktivačních a detoxifikačních metabolitů. Již v dřívějších pracích byly identifikovány jednotlivé isoformy CYP, které se podílí na oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce, ledviny) laboratorního potkana, vhodného modelu ilustrujícího osud ellipticinu v lidském organismu. V této diplomové práce byl studován vliv ellipticinu na obsah a aktivitu cytochromů P450 a na dalších složek MFO systému v tomto zvířecím modelu. Pro stanovení obsahu CYP a dalších složek MFO systému v isolovaných mikrosomech byly využity spektroskopické a elektrochemické metody. Pro stanovení katalytické aktivity CYP a NADPH:cytochrom P450 reduktasy byly využity reakce se specifickými substráty. Z výsledků vyplývá, že u zvířat premedikovaných ellipticinem dochází k zvýšení exprese i katalytické aktivity CYP podrodiny 1A ve všech testovaných orgánech (játra, ledviny, plíce). V játrech navíc dochází vlivem ellipticinu ke zvýšení exprese cytochromu b5 a zvýšení exprese a katalytické aktivity CYP3A. Podobně se i obsah a katalytická aktivita NADPH:cytochrom P450 reduktasy měnila v závislosti na premedikaci zvířat ellipticinem. Cytochrom P450 2S1...
|
|
|
Studium vlivu vybraných inhibitorů proteinkináz na lékovou rezistenci zprostředkovanou cytochromy P450
Janoušková, Adéla ; Hofman, Jakub (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Adéla Janoušková Školitel: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Název diplomové práce: Studium vlivu vybraných inhibitorů proteinkináz na lékovou rezistenci zprostředkovanou cytochromy P450 Farmakokinetická léková rezistence často vede k selhání protinádorové léčby. Jedním z mechanizmů je zvýšený eflux léčiv z nádorových buněk, přičemž některé studie naznačují, že dalším mechanizmem by mohlo být zvýšené odbourávání léčiv na neaktivní metabolit. Cílem této práce bylo definovat možnou roli enzymů CYP3A4 a CYP2C8 ve fenoménu farmakokinetické rezistence a prozkoumat možnosti jejího ovlivnění novými cílenými léčivy. V první části jsme využili MTT proliferační metodu spolu s HepG2 buňkami stabilně transdukovanými příslušnými lidskými enzymy a prokázali signifikantní účast CYP3A4 na rezistenci vůči docetaxelu. V navazující části jsme pomocí komerčního kitu zkoumali inhibiční účinky čtyř vybraných inhibitorů tyrozinkináz vůči enzymu CYP3A4 v intaktních buňkách. Kobimetinib a dabrafenib vykazovaly signifikantní inhibiční aktivitu, zatímco osimertinib a brivanib nikoliv. V závěrečné části jsme pomocí MTT testu demonstrovali schopnost prvních dvou zmíněných léčiv modulovat rezistenci k docetaxelu, jež je...
|
|
|
Metabolismus inhibitorů tyrosinkinas, protinádorových léčiv nové generace
Čillíková, Olívia ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Nádorová onemocnění jsou po infarktu myokardu druhou nejčastější příčinou úmrtí ve světě. V posledních letech se výzkum v rámci cílené chemoterapeutické léčby zaměřil na inhibitory tyrosinkinas. Vandetanib je tyrosinkinasový inhibitor ovlivňující receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR), přesmyk během transfekce (RET) a receptor 2 vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGFR-2). Primárně se využívá k léčbě medulárního karcinomu štítné žlázy. V lidském organismu je vandetanib biotransformován pomocí cytochromů P450 (CYP) a flavinmonooxygenas. Vandetanib je pomocí CYP oxidován pouze na jeden klinicky stejně účinný metabolit, a to N-desmethylvandetanib. CYP při biotransformaci chemických látek využívají primárně kofaktor NADPH. Předkládaná práce se zaobírá vlivem různých typů kofaktorů na oxidaci vandetanibu pomocí vybraných lidských rekombinantních cytochromů P450, a to CYP2C8 koexprimovaným s cyt b5, CYP2D6, CYP3A4 a CYP3A4 koexprimovaným s cyt b5, u nichž byla dříve prokázána účinná oxidace vandetanibu. Zkoumali jsme jak kofaktory NADPH, NADH a jejich směs v poměru 1:1 ovlivňují množství vzniklého N-desmethylvandetanibu při biotransformaci vandetanibu. Dále byl sledován vliv pH na oxidaci vandetanibu pomocí CYP3A4 a CYP3A4 koexprimovaného s cyt b5. Konkrétně jsme měřili množství...
|
host ::
RSS.