|
|
Advanced fluorescence techniques applied on biomolecules (lipid membranes and DNA)
Beranová, Lenka ; Hof, Martin (vedoucí práce) ; Svoboda, Petr (oponent) ; Večeř, Jaroslav (oponent)
Tato práce popisuje dvě pokročilé fluorescenční metody: metodu zkoumající časový vývoj Stokesova posunu fluorescenčního spektra (TDFS) a fluorescenční korelační spektroskopii (FCS) včetně jejích speciálních obměn - časově rozlišené FCS, Z-scan FCS a dvojohniskové FCS. Metody byly aplikovány ve výzkumu DNA a lipidových membrán. Přispěli jsme k objasnění mechanismu kondenzace molekul DNA menších, než je rozlišovací schopnost konfokálního mikroskopu. Kondenzace polykationem sperminem je zřejmě proces diskrétní ("all or non"), při použití kladně nabitého surfaktantu kondenzace probíhá naopak postupně. Dále jsme zkoumali biofyzikální vlastnosti fosfolipidové membrány ovlivněné přítomností oxidovaných lipidů se zkráceným sn-2 řetězcem. Jejich vlivem v membráně vzrostla pohyblivost a hydratace v oblasti lipidových hlaviček. Tento efekt je ve shodě s molekulovými simulacemi, které ukázaly reorientaci krátkých sn-2 řetězců oxidovaných lipidů. Přítomnost oxidovaných molekul může také ovlivňovat difuzi lipidů v membráně, pozorovali jsme mírně zvýšený difuzní koeficient. Zkoumali jsme také vliv těžké vody na fosfolipidovou membránu. Přítomnost D2O způsobuje snížení pohyblivost a hydratace oblasti lipidových hlaviček, což je v souladu se simulacemi, které ukazují zvýšení dob života vodíkových vazeb mezi molekulami vody...
|
|
|
Fluorescence Spectroscopy: Advanced methods and their defined applications in protein science
Pospíšil, Petr ; Hof, Martin (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent) ; Polívka, Tomáš (oponent)
Pro správnou funkci biomolekul je zásadní jejich hydratace a dynamika. V této disertační práci bylo vyvinuto a aplikováno několik různých fluorescenčních technik pro zkoumání vlastností a jejich změn během vzájemných interakcí biomolekul. Jako první byla použita solvatační relaxační technika založená na časově-rozlišeném fluorescenčním posunu ke studiu interakcí DNA s proteiny a lipidy pomocí nově syntetizovaného fluorenového fluoroforu kovalentně navázaného na DNA. Druhá studie pomocí Badanu navázaného na klíčový cystein-proline- cystein motiv zkoumá ATPázu transportující měděné ionty, pro jejíž funkci se ukázalo být důležité vytváření různých stupňů hydratace. Další studie, která se detailně zabývá zhášením Badanu a Prodanu, odhalila limity časově-rozlišeného fluorescenčního posunu, což je podstatné pro další aplikace této metody. Čtvrtá studie se pomocí fluorescenční up-konverzní metody zabývá efektem "těžkých atomů" na relaxaci excitovaného stavu metalovaných corrolů, které se jeví jako velmi slibné fluorofory v biologické zobrazování. Výsledky této studie pomohou v dalším ladění požadovaných optických vlastností corrolů, vyvíjených pro nejrůznější aplikace. Jako poslední byla využita fluorescenční korelační spektroskopie pro studium kooperačních efektů dvou antimikrobiálních peptidů, PGLa a...
|
|
|
Bakteriální RTX proteiny a jejich vazebná místa pro vápník.
Lišková, Petra ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent) ; Hof, Martin (oponent)
Protein FrpC je produkovaný bakterií Neisseria meningitidis v lidském hostiteli. Tento protein je charakteristický přítomností RTX domény, která jej řadí do stejnojmenné rodiny bakteriálních toxinů. Protein FrpC vykazuje unikátní autokatalytickou štěpící aktivitu, kterou zajišťuje 177 aminokyselin dlouhá část (SPM, Self-Processing Module). Bez navázaného Ca2+ zaujímá SPM neuspořádanou strukturu. Po vazbě iontu se protein sbalí a je schopen vykonat enzymatickou aktivitu. Analýza struktury sbaleného SPM by mohla odhalit funkční souvislosti vazby iontu a autokatalytického sestřihu. Bohužel řešení struktury SPM pomocí NMR se ukázalo být velmi obtížné kvůli dlouhé nestrukturované části sekvence uvnitř SPM. Předmětem této práce se tedy stal popis SPM pomocí fluorescenčních metod, charakterizace vazby iontu do SPM, tak i strukturních změn, které se v průběhu vazby Ca2+ odehrávají. Byla stanovena disociační konstanta vazby kovového iontu do SPM, kD~17 µM, která se nachází v koncentračním rozmezí Ca2+, kdy dochází ke sbalování SPM proteinu (1-20 µM). Součástí pochopení struktury SPM bylo zjištění, že obě tryptofanová rezidua Trp451 a Trp519 v SPM interagují jak s navázanými ionty, tak spolu navzájem. Pro tento účel byly použity plně funkční varianty SPM s jedním tryptofanem, W451F a W519F, a luminiscenční...
|
|
|
Supported Phospholipid Bilayers and their Interactions with Proteins Studied by Ellipsometry, Atomic Force Microscopy and Confocal Fluorescence Microscopy
Macháň, Radek ; Hof, Martin (vedoucí práce) ; Fidler, Vlastimil (oponent) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Podporované lipidové dvojvrstvy sloužily jako umělý model biologických membrán při studiu membránové aktivity 5 vybraných antimikrobiálních peptidů. Hlavními experimentálními technikami byly elipsometrie, laserová řádkovací mikroskopie a fluorescenční korelační spektroskopie. Základní principy použitých experimentálních technik jsou vysvětleny v této práci s přihlédnutím k jejich stránkám podstatným pro charakterizaci lipidových dvojvrstev. Ve stručnosti je shrnut biologický význam antimikrobiálních peptidů a jejich působení na biologické membrány a jsou představeny základní vlastnosti vybraných peptidů. Následuje rozbor hlavních typů experimentálních studií a interpretace jejich výsledků. Morfologické změny lipidových dvojvrstev byly zkoumány elipsometrií a laserovou řádkovací mikroskopií. Nejzajímavější jevy byly pozorovány v případě melittinu, který vyvolal vznik dlouhých lipidových trubic vystupujících z dvojvrstvy. Laterální difúze lipidů měřená fluorescenční korelační spektroskopií vypovídá o uspořádání dvojvrstvy na vzdálenostech pod rozlišením optické mikroskopie.
|
|
|
Anisotropické optické vlastnosti fluorescentních proteinů
Rybakova, Olga ; Lazar, Josef (vedoucí práce) ; Hof, Martin (oponent)
Fluorescenční proteiny (FP) jsou velice důležité pro moderní biologické molekulární zobrazování. Důležité zobrazovací techniky (jako je polarizační mikroskopie nebo FRET zobrazování) využívají anisotropických optických vlastnosti fluorescenčních proteinů. V této práci prezentujeme výsledky polarizační mikroskopie a rentgenových difrakčních experimentů na krystalech FP, jakož i matematickou interpretaci těchto výsledků, poskytující informace o směrovosti jedno- a dvoufotonové absorpce v rámci molekul zkoumaných fluorescenčních proteinů. Pro anizotropii jenofotonové absorpce určujeme orientaci dipólových momentů přechodu ve třech reprezentativních fluorescenčních proteinech. Porovnání naměřených hodnot s dostupnými kvantově-mechanickými předpověďmi a experimentálně stanovenou orientací dipólového momentu přechodů GFP nám dává důvěru k získaným výsledkům. Pro dvoufotonovou absorpci nejprve testujeme naši hypotézu, že tenzory dvoufotonové absorptivity reprezentativních FP vykazují vektorové chování. Dále pak zkoumáme použitelnost tohoto zjednodušení jako základ pro interpretaci našich mikroskopických dat dvoufotonové polarizace.
|
|
|
Model membranes studied by advanced fluorescence techniques and molecular dynamics simulations
Melcrová, Adéla ; Hof, Martin (vedoucí práce) ; Heyda, Jan (oponent) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Úvod této práce se věnuje popisu biofyzikálních vlastností modelů plazmatic- ké membrány během procesů buněčné signalizace, jako je zvýšená koncentrace cytosolické koncentrace vápníku nebo posttranslační modifikace membránových proteinů. Vápníková signalizace je charakteristická rychlým nárůstem koncen- trace vápníku v cytosolu buňky. V našem výzkumu jsme identifikovali specifická vazebná místa pro vápník a charakterizovali jeho vázání v modelech plazmatic- ké membrány se vzrůstající složitostí. Začali jsme s nejjednodušším modelem dvouvrstvy fosfolipidů, dále obohacené o cholesterol a peptidy. Nejsložitějším modelem pak jsou membrány extrahované z buněk HEK293. V experimentech používáme metodu časově závislého posunu fluorescence, která poskytuje přímou informaci o hydrataci a mobilitě v definovaných místech studované membrány. Experimenty jsou doplněny o molekulárně dynamické (MD) simulace, díky kterým získáme molekulární detail studovaných interakcí. Signalizace PAG proteinu je spuštěna jeho dvojí palmitoylací. Naše studium je zaměřeno na změny v biofyzikálních charakteristikách jak samotného peptidu, tak okolní lipidové membrány po připojení těchto palmitoylů. Za pomoci ato- mistických MD...
|
|
|
Vliv deplece cholesterolu na signální dráhu iniciovanou receptory spřaženými s G proteiny třídy Gq/G11
Ostašov, Pavel ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent) ; Hof, Martin (oponent)
Membránové domény jsou důležitou strukturou v plazmatické membráně. Koncentrují se v nich různé signální molekuly. Jejich hlavní strukturní složkou je cholesterol a jeho odstraněním dochází k jejich narušení. Předkládaná práce se zabývá vlivem, jaký má deplece cholesterolu na signalizaci iniciovanou thyreotropním hormonem (TRH), jehož signální kaskáda se pravděpodobně nachází v membránových doménách, ač on sám není jejich součástí. S pomocí látky -cyclodextrin jsme depletovali cholesterol z plazmatických membrán. Ukázali jsme, že deplece cholesterolu vede k uvolňování Gq/11 proteinů a kaveolinu 2 z membránových domén. Také jsme ukázali, že tato deplece vede ke snížení schopnosti TRH aktivovat trimerní G proteiny stejně jako indukovat výlev Ca2+ z intracelulárních zásob. V poslední části jsme prozkoumali efekt deplece cholesterolu na mobilitu TRH receptoru v plazmatické membráně a na jeho internalizaci indukovanou TRH. K tomuto účelu byla použita linie buněk HEK 293 stabilně exprimující fuzní protein TRH-R-eGFP. Studie s pomocí konfokálního mikroskopu ukázaly, že internalizace receptoru je výrazně potlačena. Detailní analýza návratu fluorescence TRH-R-eGFP do vybělených oblastí o různých velikostech ukázala, že deplece cholesterolu zvyšuje mobilitu receptoru. Jsme přesvědčeni, že návrat fluorescence probíhá...
|
|
|
Model membranes studied by advanced fluorescence techniques and molecular dynamics simulations
Melcrová, Adéla ; Hof, Martin (vedoucí práce)
Úvod této práce se věnuje popisu biofyzikálních vlastností modelů plazmatic- ké membrány během procesů buněčné signalizace, jako je zvýšená koncentrace cytosolické koncentrace vápníku nebo posttranslační modifikace membránových proteinů. Vápníková signalizace je charakteristická rychlým nárůstem koncen- trace vápníku v cytosolu buňky. V našem výzkumu jsme identifikovali specifická vazebná místa pro vápník a charakterizovali jeho vázání v modelech plazmatic- ké membrány se vzrůstající složitostí. Začali jsme s nejjednodušším modelem dvouvrstvy fosfolipidů, dále obohacené o cholesterol a peptidy. Nejsložitějším modelem pak jsou membrány extrahované z buněk HEK293. V experimentech používáme metodu časově závislého posunu fluorescence, která poskytuje přímou informaci o hydrataci a mobilitě v definovaných místech studované membrány. Experimenty jsou doplněny o molekulárně dynamické (MD) simulace, díky kterým získáme molekulární detail studovaných interakcí. Signalizace PAG proteinu je spuštěna jeho dvojí palmitoylací. Naše studium je zaměřeno na změny v biofyzikálních charakteristikách jak samotného peptidu, tak okolní lipidové membrány po připojení těchto palmitoylů. Za pomoci ato- mistických MD...
|
|
|
The study on interactions of functional surfaces with biological systems
Víšová, Ivana ; Lísalová, Hana (vedoucí práce) ; Hof, Martin (oponent) ; Stephanopoulos, Nicholas (oponent)
Název: Studium interakcí funkčních povrchů s biologickými systémy Author: Ivana Víšová Školící pracoviště: Fyzikální ústav AV ČR, v. v. i., Oddělení optických a biofyzikálních systémů Vedoucí práce: RNDr. Hana Vaisocherová-Lísalová, Ph.D., Fyzikální ústav AV ČR, v. v. i., Oddělení optických a biofyzikálních systémů Abstrakt: Tato práce je věnovaná studiu procesů ovlivňujících výkonnost funkčních rezistentních (antifoulingových) povlaků na bázi polymerních kartáčů a jejich interakcí s komplexními biologickými médii. Prezentovaný základní i aplikovaný výzkum se týká i) funkcionalizačních procesů ovlivňujících odolnost povlaků, ii) přizpůsobení fyzikálně- chemických vlastností antifoulingových povlaků, aby se minimalizovaly nespecifické interakce s komplexními biologickými vzorky, a iii) chování, odolnosti a funkčnosti polymerních kartáčů v různých komplexních prostředích. Studovány jsou polymerní kartáče na bázi akrylamidu a methakrylamidu s postranními hydroxylovými, karboxybetainovými a sulfobetainovými skupinami, jejichž optimalizované kopolymerní struktury vykazují velký potenciál jako laditelné antifoulingové funkcionalizovatelné platformy pro buněčný výzkum, nebo aplikace v oblasti biosenzorů. Nově vyvinuté postupy pro obnovení resistence povlaku na bázi poly(karboxybetainů) po aktivaci EDC / NHC a...
|
|
|
Model membranes studied by advanced fluorescence techniques and molecular dynamics simulations
Melcrová, Adéla ; Hof, Martin (vedoucí práce)
Úvod této práce se věnuje popisu biofyzikálních vlastností modelů plazmatic- ké membrány během procesů buněčné signalizace, jako je zvýšená koncentrace cytosolické koncentrace vápníku nebo posttranslační modifikace membránových proteinů. Vápníková signalizace je charakteristická rychlým nárůstem koncen- trace vápníku v cytosolu buňky. V našem výzkumu jsme identifikovali specifická vazebná místa pro vápník a charakterizovali jeho vázání v modelech plazmatic- ké membrány se vzrůstající složitostí. Začali jsme s nejjednodušším modelem dvouvrstvy fosfolipidů, dále obohacené o cholesterol a peptidy. Nejsložitějším modelem pak jsou membrány extrahované z buněk HEK293. V experimentech používáme metodu časově závislého posunu fluorescence, která poskytuje přímou informaci o hydrataci a mobilitě v definovaných místech studované membrány. Experimenty jsou doplněny o molekulárně dynamické (MD) simulace, díky kterým získáme molekulární detail studovaných interakcí. Signalizace PAG proteinu je spuštěna jeho dvojí palmitoylací. Naše studium je zaměřeno na změny v biofyzikálních charakteristikách jak samotného peptidu, tak okolní lipidové membrány po připojení těchto palmitoylů. Za pomoci ato- mistických MD...
|
host ::
RSS.