|
|
Příprava mutantních forem cytochromu b5 s fotoreaktivními aminokyselinami a jejich síťování s vazebnými partnery
Landl, David ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Cytochrom b5 plní funkci přenašeče elektronů v klinicky významném systému oxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému). Tento systém se podílí na zvýšení hydrofility látek v první fázi biotransformace xenobiotik a na aktivaci nebo deaktivaci některých léčiv a karcinogenů. Cytochrom b5 ovlivňuje reakce katalyzované terminálními oxygenasami systému - cytochromy P450. Donory elektronů cytochromu b5 jsou NADH:cytochrom b5 reduktasa a NADPH:cytochrom P450 reduktasa Cílem této práce bylo ověřit, zda je možné pomocí metody foto-chemického zesítění fixovat transientní interakce mezi těmito proteiny. Takto získané kovalentní komplexy mohou být dále analyzovány pomocí hmotnostní spektrometrie a poskytují strukturní informace o vazebných místech proteinů. Pro účely foto-síťování byl připraven mutantní cytochrom b5 obsahující v sekvenci v pozici 41 foto-aktivovatelný analog methioninu. Protein jsme exprimovali ve 300 ml limitního média, ve kterém byl methionin nahrazen L-2-amino-5,5-azi-hexanovou kyselinou (foto-methionin), a použili k tomu auxotrofní kmen bakterií E. coli B834(DE3). Míra inkorporace nepřirozené aminokyseliny byla po 16 h exprese stanovena pomocí hmotnostní spektrometrie na přibližně 40 %. Izolací jsme získali celkem 15,4 nmol mutantního cytochromu b5 o koncentraci 76,8 µmol/l. Získaný...
|
|
|
Endokrinní disruptory a jejich vliv na expresi cytochromu P450 1A2
Orlovská, Ľubica ; Dračínská, Helena (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Termín "endokrinní disruptor" se používá pro sloučeniny, které napodobují nebo antagonizují účinky endogenních hormonů, mění syntézu a metabolismus přirozených hormonů nebo modifikují hladiny hormonálních receptorů. Syntetický estrogen 17α- ethinylestradiol (EE2) a karcinogenní látka znečišťující životní prostředí, benzo[a]pyren (BaP), patří do skupiny chemikálií, které jsou označeny jako exogenní sloučeniny s endokrinní destrukcí, zatímco estrogenový hormon 17β-estradiol (EST) je přírodní endogenní endokrinní disruptor. V bakalářské práci byl studován vliv těchto endokrinních disruptorů a jejich kombinací na expresi a specifickou aktivitu CYP1A2. V rámci této práce byla izolována RNA z plic potkanů nepremedikovaných a premedikovaných uvedenými endokrinními disruptory. Metodou reverzní transkripce byla RNA převedena na cDNA. Relativní zastoupení CYP1A2 bylo kvantifikováno metodou kvantitativní PCR v játrech, ledvinách a plicích. Ve vzorcích mikrosomální frakce jater byla stanovena míra exprese CYP1A2 metodou Western blot s následnou imunodetekcí. Nakonec byla v játrech stanovena specifická aktivita CYP1A2 měřením O-demethylace 7-methoxyresorufinu. Bylo potvrzeno, že BaP indukuje genovou expresi CYP1A2 v játrech, ledvinách a plicích, a to i v kombinaci s EE2 a EST. Oba estrogeny nicméně snižují...
|
|
|
Studium protein-proteinových interakcí v bakteriální pathogenesi: využití metodiky PIXL (photo-induced cross-linking)
Žídek, Radek ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Gramnegativní bakterie druhu Bordetella pertussis jsou původci smrtelného lidského onemocnění označovaného jako pertuse, častěji jako černý kašel. Tyto bakterie produkují adenylátcyklázový toxin (ACT), který se váže na povrch makrofágů a umožňuje vpravit do cytosolu hostitelské buňky přes cytoplazmatickou membránu adenylátcyklázovou doménu (dAC). Abychom mohli studovat kovalentní interakce mezi proteiny pomocí fotochemického zesítění, byl náš studovaný protein exprimován s foto-methioninem (kyselinou L-2-amino-5,5- azi-hexanovou) v kultivačním médiu v bakteriálním kmenu Escherichia coli B834 (DE3). Foto- methionin je netoxickým analogem L-methioninu, takže je normálně inkorporován pomocí aminoacyl-tRNA syntház do struktury adenylátcyklázové domény. Maximální míry inkorporace foto-methioninu do struktury dAC bylo dosaženo po optimalizaci celého expresního protokolu. Celková míra inkorporace foto-methioninu do struktury proteinu po optimalizaci zjištěná hmotnostně-spektrometrickou analýzou byla až 80 %. Získaný protein s inkorporovaným foto- methioninem byl izolován. Byly provedeny síťovací experimenty s kalmodulinem a vláknitým hemaglutininem. Při těchto experimentech bylo provedeno jak fotochemické, tak i chemické zesítění. Vzniklé kovalentně zesítěné produkty byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a...
|
|
|
Cytochrome P-450: Study of structure and interactions using chemical modification, photo-initiated cross-linking and mass spectrometry
Ječmen, Tomáš ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Petrák, Jiří (oponent) ; Šebela, Marek (oponent)
ABSTRAKT Systém oxygenas se smíšenou funkcí se v organismu podílí na biosyntéze endogenních a také metabolismu exogenních látek (např. léčiv nebo chemických prokarcinogenů). Substráty jsou biotransformovány terminálními oxygenasami systému - cytochromy P450 (P450). Katalytické vlastnosti některých jejich zástupců (např. studované izoformy 2B4) jsou pozměněny v přítomnosti redoxního partnera - cytochromu b5 (cyb5). Oba cytochromy jsou ukotveny hydrofobními doménami v lipidické membráně endoplasmatického retikula, zatímco jejich katalytické domény jsou exponovány do cytosolu buňky. K rozšíření současných znalostí o struktuře a interakcích studovaných cytochromů byly využity dva přístupy založené na kovalentním síťování aminokyselin v "nulové vzdálenosti" (angl. "zero-length cross-linking"): (1) chemické síťování činidlem 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) propojujícím ve vodném prostředí přístupné karboxylové skupiny s primárními aminy, a (2) síťování pomocí foto-labilního analogu methioninu (pMet), který se po aktivaci UV zářením může vázat na libovolnou aminokyselinu, a to v hydrofobním i hydrofilním prostředí. pMet byl do sekvence cyb5 inkorporován namísto methioninu během rekombinantní exprese proteinu v E. coli, která probíhala v limitním médiu obohaceném o aminokyselinový...
|
|
|
Mapování protein-proteinových interakcí systému cytochromu P-450 metodami chemické modifikace a hmotnostní spektrometrie
Ječmen, Tomáš ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce)
Mapování protein-proteinových interakcí systému cytochromu P-450 metodami chemické modifikace a hmotnostní spektrometrie Abstrakt Cytochromy P-450 (P450) náleží do superrodiny hemoproteinů a v organismu se podílejí na metabolismu široké škály látek, mezi které patří některá léčiva a karcinogeny. V systému oxygenas se smíšenou funkcí plní P450 funkci terminální oxygenasy. Nezbytnou součástí je také NADPH: cytochrom P450 reduktasa (CPR), která je zodpovědná za přenos dvou elektronů na P450 v průběhu jeho katalytického cyklu. Druhý elektron může místo CPR přenášet na P450 také cytochrom b5 (cyt b5). Pro pochopení reakčního mechanismu P450 je nezbytná znalost jeho terciární struktury. V současnosti je v naší laboratoři k dispozici homologní model cytochromu P-450 2B4 (CYP 2B4). Presentovaná diplomová práce měla za cíl označení vazebné domény CYP 2B4 pro cyt b5. Ke studiu bylo použito síťovací činidlo EDC tvořící amidickou vazbu mezi aminokyselinami s opačně nabitými bočními řetězci. Pomocí hmotnostní spektrometrie se nám podařilo nalézt pět párů kovalentně propojených aminokyselin. K ověření a ke zpřesnění modelu CYP 2B4 byla použita metoda fotoafinitního značení se sondou N-(p-azidobenzyl)-N-methyl-p-aminophenylaminu. Tato sloučenina se ligandově váže na centrální atom železa hemu. Po fotoaktivaci byl pomocí...
|
|
|
Kooperativita v systému monooxygenas cytochromů P450 z pohledu modulace metabolismu léčiv a procesu karcinogenese
Dědič, Jan ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Systém oxidas a oxygenas se smíšenou funkcí se velkou měrou podílí na metabolismu xenobiotik a endogenních látek. Systém je složen z několika komponent: cytochromu P450, NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy (CPR), cytochromu b5 a NADH:cytochrom b5 oxidoreduktasy. Bylo prokázáno, že všechny komponenty mezi sebou vzájemně interagují a zajišťují tak chod celého systému. Kooperativita celého systému je pak závislá na mnoha faktorech, zejména pak na charakteru interakcí mezi jednotlivými komponentami. Zřejmě nejdiskutovanějšími interakcemi jsou ty mezi CPR, cytochromem b5 a cytochromem P450. Hlavním redoxním partnerem cytochromu P450 je CPR, která při transportu elektronů prochází významnou konformační změnou. Cytochrom b5 může mít jak inhibiční tak i stimulační účinky na enzymovou reakci a mechanismus jeho působení nebyl dosud plně objasněn. Cytochromy P450 však mohou interagovat i mezi sebou a vytvářet tak komplexy, jejichž existence může mít na enzymovou reakci značný vliv. U kooperativity systému však z hlediska charakteru enzymové reakce nezáleží pouze na kvantitativních jevech, jako jsou inhibice nebo stimulace. Ukazuje se, že záleží také na kvalitativních efektech, neboť bylo prokázáno, že určité změny ve vzájemných interakcích komponent mohou vést k tvorbě nežádoucích produktů, např. při...
|
|
| |
|
|
Mapování protein-proteinových interakcí systému cytochromu P-450 metodami chemické modifikace a hmotnostní spektrometrie
Ječmen, Tomáš ; Černá, Věra (oponent) ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce)
Cytochromy P-450 (P450) náleží do superrodiny hemoproteinů a v organismu se podílejí na metabolismu široké škály látek, mezi které patří některá léčiva a karcinogeny. V systému oxygenas se smíšenou funkcí plní P450 funkci terminální oxygenasy. Nezbytnou součástí je také NADPH: cytochrom P450 reduktasa (CPR), která je zodpovědná za přenos dvou elektronů na P450 v průběhu jeho katalytického cyklu. Druhý elektron může místo CPR přenášet na P450 také cytochrom b5 (cyt b5). Pro pochopení reakčního mechanismu P450 je nezbytná znalost jeho terciární struktury. V současnosti je v naší laboratoři k dispozici homologní model cytochromu P-450 2B4 (CYP 2B4). Presentovaná diplomová práce měla za cíl označení vazebné domény CYP 2B4 pro cyt b5. Ke studiu bylo použito síťovací činidlo EDC tvořící amidickou vazbu mezi aminokyselinami s opačně nabitými bočními řetězci. Pomocí hmotnostní spektrometrie se nám podařilo nalézt pět párů kovalentně propojených aminokyselin. K ověření a ke zpřesnění modelu CYP 2B4 byla použita metoda fotoafinitního značení se sondou N-(p-azidobenzyl)-N-methyl-p-aminophenylaminu. Tato sloučenina se ligandově váže na centrální atom železa hemu. Po fotoaktivaci byl pomocí MS techniky nalezen adukt argininu 197 s fotoaktivovanou sondou. Oba presentované výsledky ukazují správnost zvolených metodických...
|
|
|
Ekonomické důsledky rozdělení Československa v roce 1993.
Ječmeň, Tomáš ; Tóth, Andrej (vedoucí práce) ; Chalupecký, Petr (oponent)
Cílem práce je analyzovat hospodářské a politické aspekty rozpadu Československa v roce 1993 v kontextu měnové odluky a dále analyzovat její vliv na monetární ukazatele v České republice a Slovenské republice. Práce poskytuje ucelený pohled na vývoj vztahů v rámci Československa po roce 1989 a měnovou odluku v roce 1993. Nejprve je pozornost zaměřena na deskripci a analýzu hospodářských a politických vztahů mezi oběma národy, které jsou demonstrovány na ilustrativních příkladech z vývoje Československa mezi lety 1989 až 1993. Poté práce analyzuje přípravu, průběh a vliv měnové odluky na vývoj míry inflace, platební bilance, úrokové míry a devizových rezerv a následně jsou komparovány makroekonomické ukazatele obou nově vzniklých států. Práce je psána za s použitím deskripce, analýzy a komparace. Na základě analýzy lze konstatovat, že rozpadu státu již nebylo možné v roce 1993 zabránit. Dále lze usuzovat, že měnová odluka neměla bezprostřední zásadní vliv na zkoumané monetární ukazatele. Na základě komparace vybraných makroekonomických ukazatelů daných států se podařilo prokázat, že v prvních letech po rozpadu federace se ekonomika České republiky vyvíjela lépe a stabilněji. Provedení a výsledky rozdělení Československa a s tím související měnová odluka je možné považovat za podklad pro řešení aktuálních problémů např. v oblasti případného dělení společné měny v Evropské unii nebo případného rozpadu více národnostních států. Správně provedená měnová odluku v roce 1993 neměla negativní vliv na vývoj monetární veličin zkoumaných států.
|
|
|
Finanční stabilita nadačních fondů v ČR
Ječmeň, Tomáš ; Ježek, Tomáš (vedoucí práce) ; Doležalová, Antonie (oponent)
Tématem bakalářské práce je finanční stabilita, problém vícezdrojového financování nadací a nadačních fondů v České republice a srovnání s nadačními subjekty v období první republiky. První část charakterizuje základní pojmy z neziskového sektoru. Druhá část analyzuje problém finanční stability a kritéria použitá pro tuto práci. Třetí část bakalářské práce se zabývá konkrétními nadačními fondy, jejich finanční stabilitou a doporučeními pro zlepšení. Závěr shrnuje důležité prvky celé práce.
|
host ::
RSS.