|
|
Carbohydrate dimers in tumor immunotherapy
Krupová, Monika ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Využití sacharidových dimerů v imunoterapii nádorů Monika Krupová (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze) Jednou ze strategií pro imunoterapii nádorů je aktivace cytotoxických lymfocytů pomocí ligandů specifických pro jejich povrchové receptory. CD69 je široce rozšířeným receptorem na povrchu mnoha buněk hematopoietického původu, a protože jeho fyziologický ligand nebyl zatím popsán, na modulaci jeho funkcí se dají použít různá ligandová mimetika. Mimetika testované v předkládané práci jsou založené na mono- či disacharidech spojených pomocí dvou různých funkčních skupin, které tvoří thiomočovinovou a triazolovou sérii. Při precipitačních studiích byla sledována schopnost precipitovat rozpustný NKR-P1 a CD69 receptor, přičemž se zjistilo, že optimalizovaná délka spojky pro navázání látky na NKR-P1 receptor je decyl. Naproti tomu aktivace receptoru CD69 neni až tak závislá na délce spojky. Cílem této práce bylo z imunologického hlediska prozkoumat vlivy jednotlivých testovaných látek na bunečnou signalizaci, cytotoxicitu vůči buňkám nádorové linie a aktivaci vyvolanou apoptózu. Největší vliv na signalizaci, sledovanou pomocí produkce inositolfosfátů a vápenatých iontů a stejně tak na přirozené zabíjení, měly látky triazolové série obsahující ve své molekule dva...
|
|
|
Úloha Mst1 / FoxO dráhy při indukci apoptosy
Lettlová, Sandra ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Liberda, Jiří (oponent)
Bylo prokázáno, že analog vitaminu E, -tokoferyl sukcinát (-TOS), jenž patří do skupiny mitokanů, která se vyznačuje tím, že účinkuje prostřednictvím mitochondrií, selektivně indukuje apoptózu v různých typech nádorových buněk pomocí generace reaktivních forem kyslíku (ROS). Akumulace ROS způsobuje nezávisle na přítomnosti proteinu p53 expresi pro-apoptotického proteinu Noxa. Zvýšená hladina Noxa proteinu vytěsní "BH3-only" protein Bak z inaktivního komplexu s anti-apoptotickým proteinem Mcl- 1, iniciuje tak tvorbu kanálů ve vnější mitochondriální membráně a tím indukci apoptózy. Současné výsledky demonstrují, že generace ROS způsobuje aktivaci Mst1 kinázy, která je součástí signalizační dráhy Hippo. Tato dráha představuje mechanismus zodpovědný za správný vývoj a velikost orgánů u mnohobuněčných organismů a její deregulace je spojena s vývojem nádorového onemocnění. Působením látky -TOS na buňky linie Jurkat bylo prokázáno, že aktivovaná Mst1 kináza fosforyluje transkripční faktor Forkhead box O1 (FoxO1), který se poté přemístí do jádra, kde aktivuje transkripci pro-apoptotických genů mezi nimiž je i NOXA. To vysvětluje indukci apoptózy nezávisle na p53 a představuje Mst1- FoxO1-Noxa dráhu jako nový mechanismus indukující apoptózu. Současný výzkum rovněž ukazuje, že Mst1 kináza ovlivňuje...
|
|
|
Příprava konstruktů pro transgenní expresi DPP-IV a FAP
Košek, Dalibor ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Křepela, Evžen (oponent)
Příprava konstruktů pro transgenní expresi DPP-IV a FAP Bc. Dalibor Košek Abstrakt: Skupina proteinů DASH (Dipeptidylpeptidase IV aktivitou a/nebo strukturou homologní) představuje soubor multifunkčních molekul, z nichž většina vykazuje peptidasovou aktivitu podobnou dipeptidylpeptidase IV (DPP-IV, EC 3.4.14.5, identická s diferenciačním antigenem lymfocytů CD26). Z proteinů i peptidů obecně odštěpují N-terminální X-Pro dipeptid. Tato práce byla zaměřena na dva proteiny, DPP-IV/CD26, kanonického představitele DASH, a fibroblastový aktivační protein alfa (FAP-α). Jedná se o transmembránové proteiny II. typu s rozdílnou tkáňovou distribucí, u nichž jsou však známé i extracelulární rozpustné varianty. Z dosavadních poznatků vyplývá, že oba mají význam v procesech vzniku a rozvoje mnoha nádorových onemocnění a to mechanismy závislými i nezávislými na enzymatické aktivitě. Pro objasnění jejich úlohy v gliomagenesi bylo navrhnuto připravit experimentální model v podobě glioblastomových buněčných linií s definovatelným fenotypem DPP-IV/CD26 a FAP-α. Bude zahrnovat enzymaticky neaktivní formy proteinů i analogy s různým subcelulárním směřováním. Takovýto model dovolí posoudit vliv DPP-IV/CD26 a FAP-α na rozvoj gliálního nádoru, význam jejich enzymové aktivity a subcelulární distribuce v tomto procesu. Experimenty...
|
|
|
Structure and function of C-type lectin NK cell receptors studied by recombinant expression and protein crystallography
Vaněk, Ondřej ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze 2010 Struktura a funkce C-lektinových receptorů NK buněk studovaná pomocí rekombinantní exprese a proteinové krystalografie Abstrakt dizertační práce Ondřej Vaněk Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. NK buňky (přirození zabíječi) byly popsány pro jejich schopnost spontánně zabíjet určité allogenní nádorové linie, a to bez jakékoliv předchozí senzitizace. NK buňky jsou součástí neadaptivní imunitní odpovědi s velmi krátkou reakční dobou vůči patogenům, jakými jsou například viry, intracelulární bakterie a parazité. Jsou také zodpovědné za eliminaci některých rakovinných buněk a mohou tak bránit rozvoji nádorové transformace a bojovat proti rozšiřování metastáz. Aktivita NK buněk je regulována pomocí rovnováhy mezi aktivačními a inhibičními signály zprostředkovanými povrchovými receptory NK buněk. Ze strukturního hlediska může být většina NK buněčných povrchových receptorů klasifikována jako C- lektinové nebo imunoglobulinové receptory. Jednou z mnoha podskupin C-lektinů jsou i lymfocytární receptory II. typu, které jsou exprimovány na NK buňkách. Předkládaná práce měla dva hlavní cíle. Prvním bylo nalezení vhodných expresních a purifikačních systémů pro vybrané C-lektinové receptory NK buněk a druhým pak provést jejich biochemickou a...
|
|
|
Nové možnosti aplikace nittrilas v biokatalýze a bioremediaci
Veselá, Alicja Barbara ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Weignerová, Lenka (oponent)
Nitrilasy jsou enzymy, jež katalyzují hydrolýzu nitrilů na karboxylové kyseliny. Pro svou chemo- a enantioselektivitu mají tyto enzymy velký potenciál pro využití v biokatalýze, např. při syntéze kyseliny mandlové a mandelamidu, nebo bioremediaci míst kontaminovaných organickými nitrily. V této práci byla studována nitrilasová aktivita rekombinantních kmenů E. coli exprimujících hypotetické fungální nitrilasy z hub Giberella moniliformis a Nectria haematococca mpVI 77-13-4 a schopnost bakterií rodu Rhodococcus a Nocardia hydrolyzovat benzonitrilové herbicidy dichlobenil (2,6-dichlorbenzonitril), ioxynil (3,5-dijod- 4-hydroxybenzonitril) a bromoxynil (3,5-dibrom-4-hydroxybenzonitril). Hypotetické fungální nitrilasy byly exprimovány jako funkční enzymy. Nitrilasa z G. moniliformis vykazovala nejvyšší aktivitu k benzonitrilu (30,9 U/mg proteinu); při kultivaci byla získána aktivita 2560 U/l buněčné suspenze. Preferovaným substrátem enzymu z N. haematococca byl fenylacetonitril (12,3 U/mg prot.), celkem bylo získáno 28050 U/l buněčné suspenze. Nitrilasa z N. haematococca byla schopna hydrolyzovat mandelonitril (5,9 U/mg prot.). Půdní bakterie Rhodococcus rhodochrous PA-34, Nocardia globerula NHB-2 a Rhodococcus sp. NDB 1165 hydrolyzovaly herbicidy ioxynil, bromoxynil a chlorovaný analog 3,5-dichlor-4-...
|
|
|
Úloha TNF-alfa a IL-10 v kardioprotektivním účinku chronické hypoxie
Chytilová, Anna ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Hloušková, Patricie (oponent)
Naším cílem bylo zjistit, zda adaptace na chronickou hypoxii ovlivní expresi TNF-α a IL-10 v srdečním svalu potkana. TNF-α patří mezi prozánětlivé cytokiny, které zesilují zánětlivou reakci. IL-10 působí opačně a potlačuje produkci zánětlivých cytokinů, včetně TNF-α. Součástí našeho experimentu bylo měření koncentrace nitrotyrosinu jako markeru poškození buněk oxidem dusnatým. K experimentům jsme použili potkany kmene Wistar, které jsme rozdělili do čtyř skupin: 1) normoxické kontroly; 2) adaptované na kontinuální normobarickou hypoxii (10% O2) po dobu tří dnů nebo 3) tří týdnů a 4) adaptované na intermitentní normobarickou hypoxii (10% O2) po dobu tří týdnů s jednohodinovou denní reoxygenací. Z myokardu levé komory, pravé komory a mezikomorového septa jsme získali proteiny obsažené v cytosolu (cytosolická frakce) a v membránách (partikulární frakce). Metodou ELISA jsme změřili koncentrace TNF-α a IL-10 v obou frakcích. Kontinuální hypoxie zvýšila hladinu TNF-α v partikulární frakci všech komorových oddílů a snížila poměr koncentrací IL-10/TNF-α v partikulární i cytosolické frakci. Intermitentní hypoxie vedla k výrazné redistribuci TNF-α z cytosolu do partikulární frakce a zábránila hypoxií vyvolanému poklesu poměru koncentrací IL-10/TNF-α pouze v cytosolické frakci. Nejvyšší koncentraci...
|
|
|
Význam aktivačních a inhibičních ligandů na leukemických blastech pro stimulaci NK buněk.
Imryšková, Zuzana ; Hromadníková, Ilona (vedoucí práce) ; Bezouška, Karel (oponent)
V posledních desetiletích se s rozvojem imunologických a molekulárně biologických metod vyvíjí nové diagnostické a léčebné postupy, které umožňují včasnou diagnostiku choroby, zajišťují stratifikaci pacientů do léčebných skupin a směřují k individuální terapii. Naprosto zřetelné jsou výsledky týkající se leukémií. Současné léčebné postupy umožňují nejen delší přežití pacientů, ale často i jejich trvalé vyléčení. Avšak věda jde ještě dále, v současné době probíhá intenzivní výzkum imunoterapie NK buňkami, která by mohla doléčit minimální reziduální nemoc po chemoterapeutické léčbě, způsobenou perzistentními maligními buňkami. Další výhodou tohoto léčebného postupu je eliminace systémového onemocnění v důsledku přesně cílené léčby. V této práci jsme se věnovali in vitro testování možnosti využití imunoterapeutické léčby NK buňkami u akutní a chronické myeloidní leukémie a akutní lymfoblastické leukémie. Metodou průtokové cytometrie jsme detekovali aktivační a inhibiční ligandy na leukemických blastech odvozené od molekul MHC I. třídy (MIC-A, MIC-B), molekuly MHC I. třídy (HLA- E) a UL-16 vazebné proteiny (ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3 a ULBP-4). Dále jsme se věnovali detekci exprese inducibilního proteinu tepelného šoku Hsp70 na plazmatické membráně a v cytosolu monoklonální protilátkou cmHsp70.1 FITC...
|
|
|
Možnosti ovlivnění odpovědi buněk přirozené imunity na gliadin
Drašarová, Hana ; Tučková, Ludmila (vedoucí práce) ; Bezouška, Karel (oponent)
Celiakie je chronické zánětlivé onemocnění sliznice tenkého střeva, které se projevuje u geneticky predisponovaných jedinců po požití stravy obsahující lepek. Doposud zůstává jedinou možnou léčbou celiakie celoživotní vyloučení lepku ze stravy. Jednou ze zcela nových terapeutických strategií je použití syntetického polymeru P(HEMA-co-SS), který v gastrointestinálním traktu specificky vyvazuje gliadin a ruší tak jeho škodlivé působení na střevní sliznici. Provedené in vitro testy účinků P(HEMA- co-SS) na lidské PBMC a střevní biopsie ukázaly, že potenciální terapeutická schopnost P(HEMA-co-SS) je velmi ovlivněna stupněm proteolytického zpracování obou komponent a také rozdílnou časovou aplikací P(HEMA-co-SS) do organismu oproti lepku. Další uvažovanou podpůrnou léčbou celiakie je používání prospěšných probiotických bakteriálních kmenů. Naše pokusy vycházely z poznatku skupiny Prof. Y. Sánz, že se liší složení bakteriální flory u pacientů s aktivní formou celiakie, u pacientů léčených bezlepkovou dietou a u zdravých jedinců. Ve spolupráci s touto skupinou jsme testovali účinek vybraných bakteriálních kmenů izolovaných z pacientů s celiakií a probiotických bakteriální kmenů na odpověď buněk přirozené imunity na gliadin. Provedené in vitro pokusy s lidskými dendritickými buňkami ukázaly, že přítomnost...
|
|
|
Studies of NK cell receptors and other proteins using recombinant expression and mass spectrometry
Kavan, Daniel ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Tučková, Ludmila (oponent) ; Řehulka, Pavel (oponent)
Univerzita Karlova v Praze P írodov decká fakultař ě Katedra biochemie Studium receptor NK bun k a jinýchů ě protein pomocí rekombinantní expreseů a hmotnostní spektrometrie Autoreferát dizertační práce Daniel Kavan Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. Praha 2010 Daniel Kavan Úvod Úvod NK bu ky a jeden z jejich receptor CD69ň ů P irození zabiječi (NK bu ky) jsou subpopulacíř ň velkých granulárních lymfocyt , kterým na bun čnémů ě povrchu schází receptory charakteristické pro B a T bu ky.ň Jsou nicmén charakterizovány p ítomností NKp46 a NKp30ě ř [Moretta L. et. al. 2002]. Pojmenování bun k p irozeníě ř zabiječi vzniklo podle funkce v organismu, protože nepot ebují žádnou p edchozí aktivaci a p esto jsou schopnyř ř ř eliminovat nenormální (tedy infikované nebo transformované) bu ky z tkánň ě [Kiessling R. et. al. 1975]. Tato funkčnost je založena na kontrole MHC molekul I. T ídyř okolních bun k. Výsledná akce (zničení nebo nezničeníě cílové bu ky) je výsledkem rovnováhy aktivačních aň inhibičních signál zprost edkovanými povrchovýmiů ř receptory a p evedenými na konkrétní signální dráhyř [Raulet D. H. et. al. 2001]. Specifita NK bun k není závislá na jediném druhuě receptoru, jako je tomu u B a T bun k, ale je dánaě r znorodostí jejich povrchových receptor [Lanier L. L.ů ů 2005]. Tyto receptory pak...
|
|
| |
host ::
RSS.