|
|
Využití transkriptomiky při studiu mechanismu působení komplexních směsí organických látek ve vnějším ovzduší se zaměřením na polycyklické aromatické uhlovodíky
Líbalová, Helena ; Topinka, Jan (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Postlerová, Pavla (oponent)
Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) tvoří rozsáhlou skupinu organických sloučenin vyskytujících se jako polutanty ve vnějším ovzduší. Kromě genotoxických účinků působí některé z nich jako kompletní karcinogeny, tzn. mají také negenotoxické a nádorově promoční vlastnosti. Ačkoli jsou účinky mnoha individuálních PAU dobře popsány, k expozici člověka ve vnějším prostředí dochází především působením komplexních směsí obsahujících PAU a pouze několik málo prací se věnuje problematice působení těchto reálných komplexních směsí. První část dizertační práce se zabývá změnami globální genové exprese v lidských embryonálních plicních fibroblastech po působení komplexních směsí obsahujících PAU extrahovaných z respirabilních prachových částic PM2.5 v ovzduší. Částice byly odebrány ve 4 lokalitách České republiky (Ostrava - Bartovice, Ostrava - Poruba, Karviná a Třeboň), které se liší mírou i zdroji znečištění ovzduší. Pro stanovení změn genové exprese jsme analyzovali buňky inkubované 24h se 3 subtoxickými koncentracemi organických extraktů částic z ovzduší (EOM) z každé lokality pomocí čipové technologie. Pro hlubší interpretaci dat jsme použili analýzu signálních drah s využitím databáze Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). V každé lokalitě jsme identifikovali deregulované signální dráhy a...
|
|
|
Regulation of alternative splicing via chromatin modifications
Hozeifi, Samira ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Lanctôt, Christian (oponent)
Alternativní sestřih je jedním z mechanismů, který slouží k rozšiřování transkriptomu a proteomu v průběhu buněčného růstu, buněčné smrti, pluripotence, buněčné diferenciace a vývoje. Jak naznačují mnohé publikace, výběr sestřihového místa se odehrává v době, kdy je nascentní RNA v těsné blízkosti chromatinu. V této práci jsem se zaměřila na studium regulace alternativního sestřihu pomocí chromatinových modifikací, a to specificky na acetylaci histonů. V první práci popisujeme efekt inhibice histonových deacetyláz (HDACs), která ovlivňuje výběr sestřihového místa u ~700 genů. Ukázali jsme, že inhibice HDACs zvyšuje acetylaci na histonu H4 a posiluje procesivitu RNA polymerázy II (RNA pol II) v okolí alternativně sestřihovaného úseku. Dalším efektem inhibice HDACs je snížení asociace sestřihového faktoru SRp40, který reguluje sestřih fibronektinového alternativního exonu. Dále jsme ukázali, že Brd2 protein, který specificky váže acetylované histony, ovlivňuje transkripci 1450 genů. Po depleci Brd2 proteinu pozorujeme změnu v alternativním sestřihu u 290 genů. Na těchto a kontrolních genech jsme prozkoumali distribuci Brd2 proteinu a zjistili jsme, že Brd2 protein je lokalizován na promotorech ovlivněných genů. Dále jsme ukázali, že interakce Brd2 s chromatinem není závislá pouze na acetylovaných...
|
|
|
Complex structural and functional analysis of individual subunits of yeast translation initiation factor 3.
Herrmannová, Anna ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Pospíšek, Martin (oponent)
7 ABSTRAKT Eukaryotická iniciace translace je komplexní proces, který je ovlivněn mnoha proteiny a proteinovými komplexy, které nazýváme translační iniciační faktory. Eukaryotický translační iniciační faktor 3 (eIF3) je komplexem více podjednotek a hraje roli hned v několika fázích iniciace translace. Iniciační faktor eIF3 se v kvasince Saccharomyces cerevisiae skládá z pěti esenciálních podjednotek (a/TIF32, b/PRT1, c/NIP1, g/TIF35, i/TIF34) a jedné neesenciální podjednotky (j/HCR1). Naším dlouhodobým cílem je porozumět tomu, jak eIF3 působí v různých fázích iniciace translace, které podjednotky nebo jejich domény hrají při těchto proceses důležitou roli, a také zmapování jeho vazebných míst na malé ribosomální podjednotce a vytvoření strukturního modelu celého komplexu. V této práci prezentuji výsledky dvou strukturních studií. První popisuje interakci objevenou pomocí NMR spektroskopie mezi RNA-rozpoznávajícím motivem lidského faktoru eIF3b a podjednotkou eIF3j. Druhá studie představuje krystalickou strukturu interakce mezi C-koncovým fragmentem kvasinkové podjednotky b/PRT1 a podjednotkou i/TIF34 v rozlišení 2,2 A. V první práci jsme ukázali, že kritické determinanty této interakce jsou konzervovány také v kvasinkách, a že jejich mutace způsobuje zpomalení růstu, eliminuje asociaci j/HCR1 s b/PRT1 in...
|
|
|
Charakterizace proteinu HelD z Bacillus subtilis
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
ÚVOD: Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) je intenzivně studovaný enzym, který je klíčový pro genovou expresi. V Laboratoři molekulární genetiky bakterií byl objeven nový protein, HelD, interagující s RNAP z bakterie Bacillus subtilis - tedy potenciální transkripční faktor. HelD je protein o velikosti cca 90 kDa, který je příbuzný s proteiny helikázové rodiny UvrD/Rep, rozplétajících DNA ve směru 3'-5'. Role proteinu HelD v buňce nicméně ještě není známá a rovněž nebyla dosud studována případná role HelD v transkripci. CÍLE: Cílem této diplomové práce bylo charakterizovat protein HelD. PŘÍSTUPY: Charakterizace HelD probíhala na třech úrovních: (i) bioinformatická analýza in silico byla použita k nalezení homologů proteinu HelD v jiných bakteriálních druzích; (ii) růstové testy in vivo byly použity pro nalezení fenotypu ΔHelD kmene v porovnání s divokým typem a (iii) biochemické experimenty in vitro byly použity k popsání efektu HelD na transkripci a k otestování, zda dokáže HelD vázat a rozplétat DNA. VÝSLEDKY: Bioinformatická analýza in silico ukázala, že protein HelD se vyskytuje u kmene Firmicutes G+ bakterií důležitých pro průmysl i medicínu. Fenotypové růstové testy odkryly, že HelD je protein důležitý pro rychlou adaptaci buňky na změny v prostředí. Biochemické experimenty ukázaly, že HelD...
|
|
|
Charakterizace transkripčního aparátu lineárních plasmidů kvasinky Kluyveromyces lactis
Sýkora, Michal ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
Transkripce je zásadním krokem exprese genetické informace. Tento proces závisí na proteinovém komplexu vícepodjednotkových RNA polymeráz, které jsou mimořádně konzervované mezi všemi buněčnými organismy. Tyto enzymy, spolu s RNA dependentními RNA polymerázami podílejícími se na umlčování genů, tvoří monofyletickou proteinovou rodinu, jejíž členové obsahují ve svém aktivním centru dva double-ψ β-barrel strukturní motivy. Do této rodiny patří také skupina převážně in silico predikovaných nekanonických DNA dependentních RNA polymeráz, které se od vícepodjednotkových RNA polymeráz odlišují redukovaným složením. Předpokládaná nekanonická RNA polymeráza, skládající se ze dvou podjednotek, je kódována také lineárními cytoplasmatickými plasmidy kvasinky Kluyveromyces lactis a velmi pravděpodobně přepisuje geny těchto plasmidů. Charakterizace unikátního transkripčního aparátu plasmidů Kluyveromyces lactis, s hlavním důrazem na nekanonickou RNA polymerázu, se stala cílem této práce. Bioinformatická analýza in silico byla použita k prověření důkazů vedoucích k předpokladu existence specifické RNA polymerázy. Následné genetické a biochemické metody byly použity pro: 1) produkci podjednotek předpokládané RNA polymerázy v několika expresních systémech; 2) testování interakce mezi některými komponentami...
|
|
|
Vliv vyřazení genu yxkO při adaptaci na enviromentální stres u rodu Bacillus.
Tkadlec, Jan ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
V předchozích letech jsme v naší laboratoři popsali mutanta Bacillus subtilis, který vykazoval snížený růst při vystavení osmotickému stresu za limitující koncentrace K+ . Tento mutantní kmen nesl přerušení v genu yxkO kódujícím předpokládanou ribokinázu. Tento gen patřící do sigma B operonu je indukován osmotickým, teplotním a etanolovým šokem. Při srovnání s divokým kmenem, má tato mutace pleiotropní vliv na fenotyp nositelského kmenu. Kromě osmosenzitivity se mutant liší tvarem buňky, schopností motility a sporulace. Naším cílem bylo zaměřit se na projevy mutace v genu yxkO u dalších bakterií z rodu Bacillus. Připravili jsme mutanty s přerušením tohoto genu, pomocí plazmidu pMUTIN4, odvozené od kmenů lišících se okolím tohoto genu a úrovní laboratorní domestikace Bacillus amyloliquefaciens a Bacillus subtilis subsp. spizizenii. Obdobně jako v předchozích studijích (u laboratorního kmenu Bacillus subtilis 168) jsme popsali u mutantního kmenu odvozeného od Bacillus amyloliquefaciens zhoršenou schopnost růstu při limitaci draslíkem a za osmotického šoku. Tento fenomén jsme studovali na úrovni dynamiky růstu bakteriální kultury. Dále jsme detekovali zvýšenou citlivost kmenu odvozeného od Bacillus amyloliquefaciens k tetracyklinu, změnu morfologie těchto buněk a jejich motility. Mutace v přírodním...
|
|
| |
|
|
Mapping of regulatory elements within 5' region of the Disp3 locus
Oltová, Jana ; Bartůněk, Petr (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
Dispatched 3 (Disp3), gen regulovaný thyroidálním hormonem, je v naší laboratoři intenzivně studován. Podle fenotypu buněk s nadexprimovaným Disp3 a expresního profilu tohoto genu by Disp3 mohl být propojujícím článkem mezi thyroidálním hormonem a homeostázou cholesterolu v mozku. Domníváme se, že by také mohl hrát roli v patogenezi některých neurodegenerativních onemocnění a mozkových nádorů. Tato práce je zaměřena na proces regulace tohoto genu prostřednictvím receptoru pro thyroidální hormon (TR). Konkrétně si dává za cíl identifikovat responsivní elementy, které jsou důležité pro tuto regulaci. Navíc byly hledány také elementy rozpoznávané jaterním receptorem X (LXR), který nasedá na stejně uspořádané repetice jako TR a existuje mnoho genů, které jsou regulovány oběma těmito receptory. Zkombinovali jsme in silico analýzu Disp3 lokusu s luciferázovými reporterovými esejemi. Zaujal nás cluster šesti responsivních elementů predikovaných v blízkosti prvního exonu, z nichž dva se ukázaly být konzervované mezi myší a člověkem. Na základě toho byly připraveny reportéry různě zkrácených variant této 3 kb dlouhé oblasti, které umožnily tuto sekvenci analyzovat detailně. Reportérové eseje nepotvrdily přítomnost žádného klíčového responsivního elementu aktivovaného TR nebo LXR, ale na 3' konci byla objevena oblast...
|
|
|
Faktory interagující s bakteriální RNA polymerázou
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Bakteriální buňka musí umět rychle měnit svou genovou expresi, aby přežila nestálé okolní podmínky. Nejvýznamnější úrovní, na které dochází ke změnám genové exprese, je transkripce. Klíčovým enzymem transkripce je RNA polymeráza (RNAP), která je regulována transkripčními faktory (TF). Tyto faktory působí na RNAP různými způsoby. V této práci je vytvořen přehled různých bílkovin a jiných faktorů, vlivu jejich funkce na transkripci a mechanismy jejich účinku. Faktory se dají rozdělit podle mnoha kritérií. Hlavním kritériem, podle kterého je sepsána i tato práce, je způsob interakce s RNAP: TF dělíme podle toho, zda se vážou jen na RNAP, nebo vážou DNA a RNAP, nebo interagují s RNA a RNAP. Tato práce přináší ucelený pohled na různé TF, kombinací jejichž působení může bakteriální buňka vytvářet přesnou a žádoucí odpověď genové exprese na změny vyvolané vnějším prostředím.
|
|
|
Stresové proteiny cytoplazmatické membrány Bacillus subtilis
Šemberová, Lenka ; Svobodová, Jaroslava (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
Stresové proteiny cytoplazmatické membrány Bacillus subtilis Grampozitivní bakterie Bacillus subtilis žije ve svrchních vrstvách půdy, kde se často setkává s výkyvy osmolarity a pH, změnami teploty či koncentrace živin. Během evoluce byly vyvinuty mechanizmy, které bakteriím pomáhají se s těmito nepříznivými vlivy vyrovnávat. Mezi ně patří i tzv. obecná stresová odpověď. Při ní dochází ke zvýšení exprese přibližně 150 genů, jejichž produkty zvané GSP (obecné stresové proteiny) minimalizují poškození buněk. Přestože je známa velikost, struktura a regulace mnoha stresových proteinů, informace o membránových stresových proteinech často chybí. V naší studii jsme se zaměřili na membránový proteom Bacillus subtilis 168 trp2-. Buňky byly během svého růstu vystaveny dlouhodobému (20 h) působení pH 5,0; resp. přítomnosti 3% v/v etanolu 30 minut. K rostoucím buňkám byl 30 minut před ukončením kultivace přidán L-[35 S]-methionin. Po dosažení střední exponenciální fáze růstu byly bakterie rychle zfiltrovány a izolovány cytoplazmatické membrány. Izolované membránové frakce byly analyzovány dvojrozměrnou elektroforézou. Z jednotlivých růstových situací byly provedeny 4 paralelní gely a porovnány s membránovým proteomem bakterií rostoucích za optimálních podmínek (tj. v komplexním médiu o pH 7,0 a teplotě 40řC). K...
|
host ::
RSS.