|
|
Studium metabolických vlastností bakterie Schlegelella thermodepolymerans v kontextu biosyntézy polyhydroxyalkanoátů
Chvátalová, Viktorie ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá metabolickými vlastnostmi termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans, která je schopná produkovat polyhydroxyalkanoáty (PHA). Cílem práce bylo pochopení metabolismu a utilizace různých sacharidů (xylóza, celobióza, glukóza a jejich kombinace) v závislosti na čase kultivace. V experimentální části byly použity dva bakteriální kmeny (M15344 a DSM15344). U bakterií byl v průběhu měření sledován nárůst optické hustoty. Dále byl stanoven obsah P(3HB) z biomasy pomocí GC-FID a molekulová hmotnost polymeru pomocí analýzy SEC-MALS. Díky měření zbytkového cukru pomocí HPLC-RI byl stanoven průběh utilizace sacharidů v závislosti na čase. Výsledky obou bakterií byly mezi sebou porovnány a vyhodnoceny. Bakterie DSM15344 prokazovala vyšší výsledky při produkci P(3HB) než bakterie M15344 a jako nejvhodnější substráty pro produkci P(3HB) se jeví celobióza a xylóza.
|
|
|
Produkce kopolymerů na bázi polyhydroxyalkanoátů pomocí bakterie Schlegelella thermodepolymerans
Černý, Vojtěch ; Černayová, Diana (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Cílem této práce bylo prostudovat schopnost různých kmenů termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans inkorporovat do struktury polyhydroxyalkanoátů (PHA) různé monomerní jednotky a tvořit tak kopolymery. Byly testovány prekurzory pro produkci monomerů mcl-PHA, 4-hydroxybutyrátu (4HB) a 3-hydroxyvylerátu (3HV). Teoretická část práce pojednává o charakteristice studovaných polymerů, jejich vlastnostech a využití, a také o termofilních organismech a jejich možnosti uplatnění v průmyslu. V experimentální části práce byly prováděny kultivace s různými prekurzory, u kterých se měnily časy přidání a koncentrace. Během těchto kultivací byly použity čtyři bakteriální kmeny S. thermodepolymerans pocházející z různých veřejných sbírek mikroorganismů. Po sérii prvotních screeningů byl vyhodnocen jako nejlepší prekurzor kyselina levulová přidaná v čase zaočkování produkčního média inokulem. Následně byla provedena kultivační série koncentrační řady, kde bylo zjišťováno, zda úprava koncentrace prekurzoru ovlivní složení kopolymeru. Při zvyšování množství prekurzoru klesalo množství biomasy a PHA, avšak vznikly velmi zajímavé materiály s vysokým obsahem 3HV. Při přidání 8 g/l prekurzoru to bylo až 52 %. Nakonec byla u vzniklých materiálů zjištěna molekulová váha polymeru pomocí gelové permeační chromatografie (SEC) s detektorem statického rozptylu světla ve více úhlech (MALS).
|
|
|
Biotechnologická produkce PHA pomocí vybraných termofilních bakterií
Marková, Lucie ; Slaninová, Eva (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Hlavními tématy této závěrečné práce jsou produkce PHA kopolymerů a studium metabolismu termofilního rodu Aneurinibacillus. Teoretická část se z velké části zaobírá obecnými vlastnostmi a vznikem PHA, dále pak bakteriemi produkujícími PHA, zejména extrémofily, a poslední kapitola je věnována konkrétně bakteriálnímu rodu Aneurinibacillus a dosavadním znalostem o těchto producentech PHA. Praktická část je zaměřena na testování PHA syntázy těchto bakterií, která vykazuje schopnost syntézy široké škály monomerů. S využitím kmenů AFN2 a AH30 byly syntetizovány různé neobvyklé kopolymery s obsahem 3HB, 3HV, 4HB, 4HV, 5HV, a dokonce i šestiuhlíkaté 3HHx a 4HHx. To vypovídá o velice rozsáhlé nespecifitě tohoto enzymu. Kopolymery byly syntetizovány díky přídavkům různých prekurzorů z řad laktonů, diolů a organických kyselin. Tyto prekurzory byly přidávány do minerálního média, které vytvářelo prostředí s limitujícím obsahem dusíku, nebo do komplexního média, které bakteriím poskytlo veškeré potřebné prvky v dostatečné koncentraci. PHA byly produkovány na obou zvolených médiích. Bakterie rodu Aneurinibacillus tedy pro syntézu PHA nevyžadují nutně prostředí s limitujícím obsahem dusíku. Za zmínku stojí výsledek kultivace kmene AFN2 na komplexním médiu s přídavkem glukózy a -valerolaktonu. Biomasa za těchto podmínek narostla do koncentrace 4,2 g/l a množství syntetizovaného PHA dosáhlo hodnoty 2,6 g/l. Tento kopolymer obsahoval bezmála 60 mol. % monomeru 4HB. V závěru experimentální části byly z testovaných prekurzorů vybrány dvě dvojice lakton-diol, které byly posléze mezi sebou porovnávány. PHA produkované na médiích s přídavky těchto prekurzorů byly následně izolovány a charakterizovány. Bylo u nich stanoveno monomerní složení a molekulová hmotnost. Kopolymery syntetizované v přítomnosti laktonů vykazovaly vždy vyšší hodnotu molekulové hmotnosti, což lze vysvětlit alkoholytickou aktivitou PHA syntázy bakterií rodu Aneurinibacillus.
|
|
|
Study on production of polyhydroxyalkanoates by psychrophilic bacteria
Šlosárová, Katarína ; Sedlář, Karel (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Bacteria produce polyhydroxyalkanoates (PHA) as intracellular storage of carbon and energy. From a technological point of view, they have great potential as biodegradable versions of conventional plastics. However, their main disadvantage compared to them is the high cost of production. Research is therefore focusing on ways to overcome this obstacle, one of which is the use of strains of extremophilic micro-organisms. However, the amount of research on psychrophiles is lower compared to other types of extremophiles. Here, the results of the first screening involving 78 cold-adapted bacterial strains isolated from East Antarctica are presented. Both genotypic and phenotypic methods were used for the selection of potential PHA producers. The polymerase chain reaction mainly demonstrated the presence of genes encoding PHA synthases, namely PHA synthases class I and II. Staining with Nile Red and Sudan Black B, as a typical initial screening method from the phenotypic level, did not provide indicative results for psychrophiles and/or psychrotolerants. In this work, FTIR spectroscopy in combination with a high-throughput microculture system (Duetz-MTPS) was used to explore the presence of PHA, which was later confirmed by gas chromatography. Cultivation was conducted on five different media. Based on all the results the highest biomass production and PHA accumulation showed Pseudomonas sp. belonging to the green snow isolates. Interestingly, a high synthesis of PHA, specifically P(3HB), was observed on complex BHI medium with extra glucose addition, which did not provide the nitrogen limitation that is typical for the stimulation of the PHA synthesis and accumulation. It can be assessed that the presence of promising producers among polar bacteria was confirmed and the yield of PHA can be further increased by optimizing the media composition and growth conditions.
|
|
|
Interaction of selected natural substances used in food industry with DNA and its structural motifs
Gardošová, Zuzana ; Pernicová, Iva (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
G-quadruplexes represent secondary DNA structures formed in guanine-rich nucleic acid regions. These structures are involved in many biological processes, including DNA replication, transcription, and telomere maintenance. Several natural substances interacting with G-quadruplex structures have been described. Many of them can be used in the treatment of cancer or other areas of therapeutic practice. G-quadruplexes are dynamic structures whose stability can be affected by a variety of different factors, including chemical modifications to DNA. One of these modifications is DNA methylation, which is an important epigenetic mechanism regulating gene expression. DNA methylation can affect the function and stability of G-quadruplex structures. The theoretical part of the present work focuses on DNA secondary structures, characterization of G-quadruplexes and their ligands and describes the relationship between DNA methylation and G-quadruplex structures. In the experimental part, the binding ability of the natural substances quercetin, berberine, piperine, and caffeine to G-quadruplex structures formed in telomeric oligonucleotide sequences and sequences derived from the proto- oncogene c-Myc was confirmed. Furthermore, the ability of berberine and quercetin was proven to stabilize G-quadruplexes in the aforementioned sequences. Bioinformatics analysis showed that the frequency of G4 is higher in CpG regions than in their surroundings, and the highest frequency of G4 within CpG regions was observed on chromosome 19. Global methylation assays demonstrated that the breast cancer cell line exhibited hypomethylation compared to the non-tumor human dermal fibroblast cell line. After treatment with berberine, the analyzed DNA of both cell lines showed hypermethylation, whereas DNA after interaction with quercetin showed hypomethylation.
|
|
|
Studium metabolismu polyhydroxyalkanoátů u vybraných termofilních bakterií
Reinohová, Nikola ; Sedláček, Petr (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zaměřuje na adaptivní evoluční inženýrství u termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans M15344. Teoretická část se zabývá extremofilními mikroorganismy, biotechnologickým využitím a taktéž polyhydroxyalkanoáty a evolučním inženýrstvím. V rámci této práce byla prováděna adaptace tohoto mikroorganismu na 40 °C a 60 °C s využitím substrátů glukózy a xylózy. Dále byla prováděna repeated-batch kultivace při 50 °C na glukóze a xylóze. V průběhu těchto experimentů byla stanovována koncentrace produkovaného PHA v biomase pomocí plynové chromatografie, dále byla stanovována koncentrace zbytkových sacharidů v médiu metodou využívající DNS. V neposlední řadě byla porovnána produkce polyhydroxyalkanoátů u adaptovaných kmenů z jednotlivých experimentů s neadaptovaným kmenem. Následně byly studovány produkované polyhydroxyalkanoáty jednotlivými bakteriemi pomocí metody SEC-MALS, kde byl pozorován vliv adaptace na molekulární hmotnost polymerů. Nejvíce produkující bakterií byla adaptovaná bakterie na 40 °C a substrátem glukózou. V tomto případě byla hodnota biomasy 6,74 g/l s procentuálním zastoupením PHA 56,5 hm.%. Taktéž se povedlo adaptovat bakterii na 60 °C, kde na rozdíl od originální bakterie byla schopna růstu i produkce.
|
|
|
Studium exprese genů u bakterie Cupriavidus necator a dalších vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů
Centnerová, Radmila ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá studiem exprese genů bakterie Cupriavidus necator H16, která je známa jako modelový organismus metabolismu polyhydroxyalkanoátů. V první části této práce byla provedena optimalizace metodiky RT-qPCR, jež byla posléze použita pro studium genové exprese. Dále byly porovnávány různé komerční kity pro izolaci genomické DNA, izolaci RNA, a pro reverzní transkripci a vznik komplementární DNA. Z dostupných kitů byl vybrán ten, se kterým bylo dosaženo nejrelevantnějších výsledků a zároveň byla snadná a bezpečná práce. Při izolaci bylo dosaženo rozdílných výtěžků pro jednotlivé kity, použitý kit má tak velmi významný vliv na kvalitu získané nukleové kyseliny a tím i na úspěšnost celého měření. Izolovaná genomická DNA byla použita pro účely optimalizace a kalibrace. Izolovaná RNA a komplementární DNA byly použity ve druhé části práce, ve které byla studovaná bakterie kultivována na různých uhlíkatých substrátech. Poté bylo pomocí optimalizované RT-qPCR metodiky provedeno studium exprese vybraných genů zapojených do biosyntézy polyhydroxyalkanoátů. Významnější změny v genové expresi byly obecně zaznamenány tehdy, když byla jako uhlíkatý substrát použita fruktóza oproti tomu, když byl použit -butyrolakton. Největší nárůst exprese genů byl při kultivaci na fruktóze zaznamenán pro gen, kterým je kódována 4-hydroxyfenylacetát-3-hydroxyláza. Při kultivaci na -butyrolaktonu byly významnější změny v expresi pozorovány pouze pro gen kódující 4-hydroxybutyrát dehydrogenázu. Výběr substrátu má tedy zásadní vliv na genovou expresi.
|
|
|
Biotechnologická produkce PHA z odpadních otrub
Guziurová, Pavlína ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá biotechnologickou produkcí polyhydroxyalkanoátů (PHA) z odpadních pšeničných otrub. Cílem bylo zjistit, zda hydrolyzát z pšeničných otrub podrobený různým typům předúpravy lze využít jako substrát pro produkci PHA pomocí vybraných bakteriálních kmenů. Vybrané kmeny byly Halomonas organivorans, Halomonas halophila a dva kmeny Schlegelella thermodepolymerans. Za nejlepší producenty byly vybrány halofilní kmeny, se kterými byly následně provedeny další kultivace. Nejefektivněji byly bakteriemi využity hydrolyzáty po neutrální předúpravě, jelikož měly nejnižší obsah mikrobiálních inhibitorů (fenolických látek), a bakterie na nich produkovaly nejvíce PHA. Nejvyšší hodnota naprodukovaného PHA bylo na hydrolyzátu s neutrální předúpravou u kmene Halomonas organivorans, konkrétně 2,82 g/l. Hydrolyzát byl využit i pro produkci kyseliny mléčné, pro kterou byly využity bakteriální kmeny Lactobacillus. Nejvyšší dosažená koncentrace naprodukované kyseliny mléčné byla 16,73 g/l u kmene Lactobacillus casei.
|
|
|
Studium produkce 3D bakteriální celulózy za využití banánových slupek jako uhlíkového zdroje
Netopilík, Tibor ; Pernicová, Iva (oponent) ; Kovalčík, Adriána (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem produkce 3D bakteriální celulózy pomocí bakterie Komagataeibacter xylinus za využití banánových slupek jako zdroje uhlíku. V teoretické části se zabývá porovnáním vlastností bakteriální celulózy a rostlinné celulózy, různými způsoby biotechnologické produkce bakteriální celulózy a jejím využitím. Cílem bakalářské práce bylo zjistit, zda je možné použít banánové slupky jako uhlíkový zdroj pro biotechnologickou produkci bakteriální celulózy. Banánové slupky jsou odpadním lignocelulozóvým materiálem vznikajícím například při výrobě přesnídávek anebo ovocných případně mléčných nápojů v potravinářském průmyslu. HPLC analýza ukázala, že 1 l hydrolyzátu po enzymatické hydrolýze 100 g suchých banánových slupek na 1 l vody obsahoval 8,86 g glukózy a 10,46 g fruktózy. Hydrolyzát byl použitý jako uhlíkový zdroj pro statickou a dynamickou kultivaci bakterie Komagataeibacter xylinus. Výtěžky bakteriální celulózy získané produkcí na hydrolyzátu byly porovnané s produkcí za použití glukózy. Zjistilo se, že použití hydrolyzátu příznivě ovlivnilo výtěžky o 170 % v případě statické kultivace a o 220 % v případě dynamické kultivace. Morfologická analýza pomocí SEM potvrdila rozdíly mezi bakteriální celulózou produkovanou staticky a dynamicky. Vliv druhu uhlíkového zdroje na morfologii bakteriální celulózy byl též patrný.
|
|
|
Využití bakterie Tepidimonas taiwanensis k produkci polyhydroxyalkanoátů na odpadních substrátech
Vidláková, Michaela ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce je zaměřena na screening produkce PHA pomocí termofilní bakterie Tepidimonas taiwanensis a na studium možného využití hroznových výlisků, melasy a odpadního papíru jako levných uhlíkatých substrátů pro kultivace charakterizované bakterie. Nejprve bylo provedeno testování základních kultivačních parametrů zahrnujících koncentraci uhlíkatého substrátu, dostupnost kyslíku, schopnost utilizace zdrojů dusíku a vybraných disacharidů. Produkce PHA z odpadních substrátů byla testována třemi způsoby. Při prvním byly jako zdroj uhlíku použity předem připravené hydrolyzáty z odpadních surovin zbavené pevného podílu. Druhý a třetí postup byl proveden nadávkováním odpadních materiálů přímo do minerálních médií, která se lišila pouze přítomností a absencí enzymového preparátu umožňujícím enzymatickou hydrolýzu dané suroviny za vzniku fermentovatelných sacharidů. Nejintenzivnější nárůst kultury a nejvyšší produkce PHA byla zaznamenána na hydrolyzátu z hroznových výlisků. Koncentrace biomasy u tohoto vzorku dosahovala až 4,8 g/l s obsahem 59 % PHA. Přídavek hroznových výlisků přímo do produkčního média se naopak vůbec neosvědčil, což bylo pravděpodobně způsobeno přítomností velkého množství inhibičních látek z výlisků. Podobně tomu bylo i u melasy a odpadního papíru, kdy byla bakterie Tepidimonas taiwanensis schopna růstu a případné produkce PHA pouze v malé míře. V rámci práce se podařilo také charakterizovat vliv teploty a pH na aktivitu enzymového koktejlu Viscozyme L a určit teplotní a pH optimum PHA syntázy bakteriálního kmene Tepidimonas taiwanensis v buněčném lyzátu.
|
host ::
RSS.