|
Strukturně-funkční aspekty adenylát cyklázového toxinu z bakterie Bordetella pertussis
Březinová, Karolína ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Brzobohatá, Hana (oponent)
Černý kašel (pertuse) je vysoce infekční onemocnění dýchacích cest, které je způsobeno Gram negativní bakterií Bordetella pertussis. I přesto, že je ve vyspělých zemích proočkovanost populace vysoká, tak pertuse patří mezi nejrozšířenější onemocnění, před kterým se lze bránit očkováním. Bakterie produkuje celou řadu faktorů virulence, které usnadňují proces kolonizace řasinkového epitelu a infekci horních cest dýchacích. Mezi nejdůležitější faktory virulence patří adenylát cyklázový toxin (CyaA). Tento toxin se řadí mezi tzv. RTX (Repeat-In-ToXins) proteiny, které jsou uvolňovány z bakterie pomocí sekrečního aparátu typu 1 (T1SS). CyaA je multifunkční toxin, vykazující jak hemolytickou, tak i cytotoxickou aktivitu. Cytotoxická aktivita toxinu je způsobena N-koncovou adenylyl cyklázovou (AC) doménou, která je napřímo dopravována přes cytoplasmatickou membránu do cytosolu buněk, kde interaguje s kalmodulinem a katalyzuje nekontrolovatelnou přeměnu adenosintrifosfátu (ATP) na cyklický adenosin-3',5'-monofosát (cAMP). Receptorem CyaA toxinu na povrchu buněk je integrinový receptor CD11b/CD18 (známý též jako komplementový receptor typu 3), který se primárně vyskytuje na fagocytujících buňkách hostitelského organismu. Tato práce se zaměřuje na strukturně-funkční aspekty toxinu CyaA a shrnuje poznatky o...
|
|
Konformace adenylátcyklázového toxinu Bordetella pertussis.
Motlová, Lucia
Tato práce se zabývá uspořádáním RTX ("Repeats in ToXin") domén vybraných RTX toxinů a vlivem těchto struktur především na balení toxinů do nativní struktury jejich sekreci a. Pro strukturní analýzu byly vybrány RTX domény ApxI (Actinobacillus pleuropneumoniae-RTX- toxin I) z bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, HlyA (Alfa-hemolysin) z bakterie Escherichia coli a LtxA (Leukotoxin A) z bakterie Aggregatibacter actinomycetemcomitans a bloky 4 a 5 RTX domény CyaA (adenylátcyklázový toxin) z bakterie Bordetella pertussis. Podařilo se získat a charakterizovat struktury RTX domény Ltxa A a RTX bloky 5 a 4-5 CyaA. Na základě SAXS (maloúhlový RTG rozptyl) modelu, dříve vyřešených struktur RTX proteinů a zde prezentovaných struktur byly vytvořeny dva modely celé rozsáhlé RTX domény CyaA.
|
|
Mechanisms underlying subversion of host immunity by Bordetella pertussis
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Filipp, Dominik (oponent)
Bordetella pertussis, původce černého kašle (známého také jako dávivý kašel nebo pertuse), je gramnegativní respirační patogen, adaptovaný na člověka. Tato bakterie produkuje řadu faktorů virulence, z nichž adenylátcyklázový toxin (ACT) a pertusový toxin (PT) hrají významnou roli při manipulaci s imunitní odpovědí hostitele v raném katarálním stádiu infekce. Ačkoli oba toxiny uplatňují svou cytotoxickou aktivitu zvyšováním hladiny cAMP uvnitř buněk, liší se od sebe navzájem svou strukturou, mechanismem sekrece i způsobem intoxikace buněk, stejně tak jako svou schopností modulovat hostitelovu adaptivní imunitní odpověď. Cílem této práce bylo definovat vztah mezi strukturou a funkcí ACT, určující mechanismus sekrece ACT sekrečním systémem typu I (T1SS), a dále rozklíčovat imunomodulační vlastnosti ACT a PT v průběhu infekce bakterií B. pertussis. Integrací různých strukturně-biologických přístupů bylo odhaleno, že RTX doména ACT sestává ze souvislého uskupení pěti β-šroubovicových bloků s navázanými Ca2+ ionty, jejichž skládáním během sekrece se vytváří vnitromolekulová Brownovská západka, zabraňující zpětnému vklouznutí sekretovaného polypeptidu do sekrečního kanálu T1SS. Tímto se urychluje sekrece ACT z bakteriálních buněk pomocí směrovaného mechanismu "vytlačování-západka". Experimentální infekce...
|
|
Příprava a charakterizace proteinových konstruktů ke strukturní analýze acylační domény adenylát cyklázového toxinu z bakterie B. pertussis
Ryvola, Vojtěch ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Černý kašel neboli pertuse je nakažlivé bakteriální onemocnění dýchacích cest způsobené bakterií B. pertussis. Navzdory velké proočkovanosti populace ve vyspělých zemích, patří černý kašel k nejrozšířenějším onemocněním, kterému lze předcházet očkováním. Bakterie B. pertussis produkuje celou řadu toxinů, které usnadňují osídlení a pomnožení bakteriálních buněk na hostitelském řasinkovém epitelu horních cest dýchacích. Jedním z těchto toxinů je adenylát cyklázový toxin, který je z bakteriálních buněk uvolňován pomocí sekrečního aparátu typu I a po jeho vápníkem-indukovaném sbalení je schopen dopravit přes cytoplasmatickou membránu hostitelských buněk svoji N-koncovou adenylát cyklázovou doménu, která po interakci s cytozolickým kalmodulinem katalyzuje přeměnu adenosintrifosfátu (ATP) na cyklický adenosinmonofosfát (cAMP). Vysoké hladiny cAMP vedou následně k poruchám buněčné signalizace a k zásadnímu omezení baktericidních funkcí fagocytujících buněk. Cílem této bakalářské práce bylo připravit a charakterizovat 'hybridní' proteinové konstrukty, které se skládají z C-koncové části acylační domény a N-koncové části RTX domény (v pozicích 881-1038 a 881-1047) napojené na C-koncovou část RTX domény (v pozici 1562-1681) nesoucí strukturní informaci pro inicializaci správného sbalení proteinové molekuly....
|
|
Role konservovaného tyrozinu acylované domény v inzerci a penetraci RTX toxinů
Lepesheva, Anna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Petráčková, Denisa (oponent)
RTX toxiny tvořící póry jsou klíčovými faktory virulence mnoha gramnegativních patogenů. Tyto proteiny sdílejí několik společných strukturních a funkčních vlastností: (i) přítomnost opakujících se sekvencí bohatých na glycin a aspartát, důležitých pro vazbu iontů vápníku, (ii) transport z cytozolu bakterií sekrečním systémem typu I (T1SS), (iii) modifikace mastnou kyselinou na specifických lyzinech v acylované doméně vlastní acyltransferázou a (iv) přítomnost amfipatické oblasti, která je zodpovědná za tvorbu pórů selektivních pro kationty. Bylo ukázáno, že aromatický postranní řetězec konzervovaného tyrozinového zbytku 940 (Y940) v acylovaném segmentu adenylátcyklázového toxinu (CyaA, ACT nebo AC-Hly) bakterie Bordetella pertussis hraje klíčovou roli v interakci toxinu s cílovou buněčnou membránou. Cílem této práce bylo ukázat, zda odpovídající konzervovaný zbytek Y940 u CyaA z bakterie Bordetella bronchiseptica, Y642 u HlyA z Escherichia coli, Y643 u ApxIA z Actinobacillus pleuropneumoniae a Y639 u RtxA z Kingella kingae, hraje stejnou kritickou roli v membránové inzerci a tvorbě pórů. Hemolytické a cytotoxické aktivity těchto homologních RTX toxinů byly plně zrušeny pouze po nahrazení konzervovaných tyrozinů prolinovými zbytky. Substituce tyrozinu za alanin mírně snížila cytolytickou kapacitu...
|
|
Immunomodulation of dendritic cells by adenylate cyclase toxin from B. pertussis
Jáňová, Hana ; Adkins, Irena (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent)
Bordetella pertusis je gram-negativní bakterie, která způsobuje onemocnění černý kašel. Mezi hlavní faktory virulence této bakterie se řadí adenylát cyklázový toxin (CyaA), který se uplatňuje v kolonizaci hostitele. Toxin se váže s vysokou afinitou na myeloidní fagocyty nesoucí na svém povrchu CD11b/CD18 integrin, proniká do jejich cytosolu a negativně ovlivňuje jejich schopnost fagocytosy, chemotaxe a oxidativního vzplanutí. Dále také CyaA ovlivňuje spektrum sekretovaných cytokinů u dendritických buněk (DC) stimulovaných LPS a moduluje jejich maturaci tím, že působí na expresi ko-stimulačních molekul. V této práci jsme se zabývali vlivem CyaA toxinu na schopnost myších DC z kostní dřeně presentovat ovalbuminové epitopy vnesené CyaA-AC- toxoidem a aktivovat CD4+ a CD8+ T-buňky. Dále jsme se snažili zjistit, zda DC ovlivněné působením CyaA snižují CD4+ T buněčnou odpověď v důsledku sníženého antigenního příjmu nebo jeho zpracování pro presentaci na MHC molekulách II. třídy. CyaA také snižuje CD8+ T-buněčné odpovědi, proto jsme se zaměřili na vliv toxinu na proteolytickou aktivitu proteasomu a na možné ovlivnění prezentace peptidů na MHC molekulách I. třídy. Zjistili jsme, že zvýšená hladina cAMP v DC snižuje presentaci ovalbuminových epitopů vnesených CyaA-AC- toxoidem na MHC molekulách I. a II....
|
|
Adenylát cyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis, jeho konformace a iontová rovnováha v hostitelské buňce.
Motlová, Lucia ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát-cyklázový (CyaA, ACT) toxin je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis. Ačkoli se CyaA váže na mnoho typů membrán, předpokládá se, že jeho receptorem je integrin CD11b/CD18, který je exprimován na povrchu myeloidních buněk. CyaA patří do rodiny RTX toxinů-hemolyzinů. CyaA působí na hostitelské buňky dvěma na sobě nezávislými aktivitami. Jednou z nich je přeměna ATP na cyklické AMP, kterou zajišťuje adenylát-cyklázová (AC) doména po translokaci do cytozolu hostitelské buňky, při které dochází ke vstupu vápenatých kationtů do hostitelské buňky. Translokace je pravděpodobně iniciována interakcí monomeru CyaA s cílovou membránou. Druhá aktivita CyaA je tvorba kanálu, selektivního pro kationty, který může způsobit koloidně osmotickou lyzi cílových buněk. Kanálo-tvorná aktivita je zajišťována RTX hemolyzinovou doménou a předpokládá se u ní oligomerizace, i když bylo zjištěno, že únik draselných kationtů z hostitelské buňky způsobuje CyaA ve formě monomeru. Také není jasné, zda by k oligomerizaci CyaA docházelo v roztoku, nebo až po interakci s hostitelskou membránou. Cílem této práce bylo zkoumat tok sodných iontů na membráně myších makrofágů J774A.1, které na svém povrchu exprimují CD11b/CD18 integrin. Pro dosažení tohoto cíle byly použity fluorescenční metody....
|
|
Příprava a charakterizace rekombinantního adenylát cyklázového toxoidu bakterie Bordetella pertussis nesoucího mykobakteriální antigen TB7.7
Mikulecký, Pavel ; Staněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Bakterie Mycobacterium tuberculosis je původcem smrtelné nemoci nazývané tuberkulóza představující celosvětový problém. Předpokládá se, že na světě žijí až dvě miliardy infikovaných lidí, u kterých bakterie přetrvává ve své latentní fázi. Specifická, citlivá, rychlá a ekonomicky dostupná metoda pro identifikaci nakažených jedinců je stále žádaná. V současné době se jako nejlepší varianta diagnostického přístupu jeví in vitro krevní testy, ve kterých se pro restimulaci specifických T lymfocytů používají mykobakteriální antigeny odvozené od virulentního kmene. Pro zvýšení efektivity dopravy antigenů do antigen prezentujících buněk se testuje mnoho přístupů, přičemž jedním z nich je geneticky detoxifikovaný adenylát cyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis. Předkládaná práce se zabývá přípravou a následnou charakterizací biologických vlastností CyaA proteinu, který ve své translokační doméně nese mykobakteriální antigen TB7.7. Experimentální výsledky ukazují, že fúzní protein CyaA-TB7.7 má zachovanou kanálotvornou aktivitu a je schopen dopravit antigeny na povrch APC s molekulami MHC II. Detoxifikovaný CyaA protein s vloženým mykobakteriálním antigenem TB7.7 bude použit pro doplnění současně testovaných přístupů, kterým je i in vitro restimulace krevních vzorků, a sloužit tak jako další...
|
|
Signalizace adenylátcyklázového toxinu bakterie Bordetella pertussis v makrofázích.
Černý, Ondřej ; Kamanová, Jana (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Souhrn Adenylátcyklázový toxin je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis, která způsobuje onemocnění černý kašel. Primárním cílem tohoto toxinu v hostitelském organismu jsou myeloidní fagocytické buňky nesoucí integrin CD11b/CD18 (αMβ2, CR3, Mac-1). Již dříve bylo ukázáno, že CyaA inhibuje zvýšením hladiny cytozolického cAMP schopnost makropinocytózy a fagocytózy v buňkách. Tato práce se zabývá studiem signální dráhy, která je zodpovědná za inhibici makropinocytózy právě přes zvýšenou vnitrobuněčnou koncentraci cAMP. Pomocí specifických aktivátorů proteinové kinázy A (PKA) a proteinu Epac jsme ukázali, že za inhibici makropinocytózy v buňkách je zodpovědná zvýšená vnitrobuněčná hladina cAMP, která dále vedla k aktivaci proteinu Epac. Dále jsme prokázali, že transfekce makrofágů konstitutivně aktivní variantou proteinu Rap1 (efektorem proteinu Epac) vedla k inhibici makropinocytózy. Naopak, exprese dominantně negativní varianty Rap1 vyvolala zvýšení makropinocytózy. Dále jsme ukázali, že inhibice jak tyrozínových fosfatáz, tak proteinové fosfatázy 2A (PP2A) vedla k obnově makropinocytózy, která byla před tím inhibovaná zvýšenou hladinou cAMP v buňkách. Získané výsledky naznačují, že signalizace cAMP přes proteiny Epac/Rap1, případně přes proteinovou fosfatázu 2A a tyrozínové fosfatázy vede...
|
|
Úloha RTX domény v aktivitě adenylátcyklázového toxinu z Bordetella pertussis
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Adenylátcyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis je protein sestávající z 1706 aminokyselin, obsahující na svém N-konci enzymatickou adenylátcyklázovou (AC) doménu a na C-konci repetitivní RTX (z angl. Repeat-in-Toxin) doménu. Přítomnost RTX domény řadí CyaA do rodiny tzv. RTX proteinů, sekretovaných z cytosolu gramnegativních bakterií sekrečním aparátem typu I (T1SS). RTX doména CyaA se skládá z pěti bloků nonapeptidových RTX repetic s konsenzuální sekvencí X-(L/I/V)-X-G-G-X-G-X-D. Cílem této práce bylo určit úlohu RTX domény v biologické aktivitě CyaA a její vliv na sekreci toxinu z buněk Bordetella pertussis. Systematická deleční analýza bloků RTX repetic ukázala, že žádná z připravených delečních variant toxinu nebyla schopna translokovat AC doménu přes cytoplazmatickou membránu do cytosolu cílových buněk a tvořit póry v membránách těchto buněk. Odstranění jednotlivých bloků RTX repetic vedlo navíc k nízké efektivitě sekrece mutant do vnějšího prostředí bakterie. Z těchto dat vyplývá, že strukturní celistvost RTX domény CyaA hraje klíčovou úlohu nejen v cytotoxické aktivitě proteinu, ale napomáhá i při jeho sekreci přes T1SS.
|