|
|
Interakční partneři proteinu eIF4E2 v lidských buňkách
Pospíšilová, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Protein eIF4E2 patří do rodiny eukaryotních translačních iniciačních faktorů 4E, za běžných okolností se ale iniciace translace neúčastní. Jeho hlavní úloha spočívá v represi translace specifických mRNA. Přesto se v podmínkách hypoxie eIF4E2 účastní iniciace translace jako podjednotka specific- kého translačního iniciačního komplexu. Přesný mechanismus působení eIF4E2 ani v jednom z procesů není znám. Jedním ze způsobů, jak roli eIF4E2 v buňce prostudovat, je zjistit, s jakými dalšími proteiny eIF4E2 interaguje. Cílem práce bylo vyhledat pomocí imunoprecipitace následované hmotnostní spek- trometrií potenciální interakční partnery eIF4E2 v buňkách linie HEK293. Kromě individuálních pro- teinů bylo cílem také identifikovat proteinové komplexy, jejichž součástí je v buňkách linie HEK293 faktor eIF4E2. Druhým směrem práce byla příprava systému pro hledání inhibitorů interakce eIF4E2 s eIF4G3. Hlavním výsledkem práce je nalezení potenciálních nových interakčních partnerů eIF4E2 v lidských buňkách.
|
|
|
Nekanonické funkce IL-1α
Novák, Josef ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Brdička, Tomáš (oponent)
1α (IL 1α) je cytokin s lépe prozkoumaná role IL 1α spouštění prozánětlivé signalizace skrze membránový receptor, ta však není předmětem této práce. terminální oblast IL 1α sice neváže receptor, ale je evolučně konzervovaná uděluje IL 1α řadu nekanonických funkcí, kterým se tato práce věnuje 1α 1α asociovat s membránami. Jaderně lokalizovaný IL 1α je terminální doménu schopný aktivovat expresi prozánětlivých genů řízených transkripčním faktorem NF κB, vázat se na histonac rázové komplexy a v rakovinných buňkách vyvolávat apoptózu. V kvasinkách byla nalezena vazba na katalytický modul histonacetyltransferázových komplexů SAGA a ADA, v lidských buňkách na komponenty homologního komplexu STAGA a Ukotvení I 1α N terminální doménou na membránu buněk slouží k prostorové lokalizaci signalizace tohoto cytokinu pouze na buňky v bezprostředním dotyku. tečně prozkoumán ani mechani mus přesunu IL 1α přes membránu, ani mechani mus kotvení 1α. Tato práce se věnuje oběma zmíněným nekanonickým funkcím. V kvasinkách popisuje 1α částečně zastoupit derepresivní funkci proteinu Snf1 na genech reprimov ných SAGA komplexem, v lidských buňkách popisuje vazbu IL 1α na nádorový supresor p53 podmínkách genotoxického stresu. V podmínkách oxidativního stresu s 1α přesunuje exinem A2, proteinem vázajícím membrány, na buněčné periferie.
|
|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
|
| |
|
|
Role sestřihových faktorů v regulaci genové exprese - vztah sestřihu a transkripce v Saccharomyces cerevisiae
Hálová, Martina ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Transkripce a úpravy primárního transkriptu jako například sestřih pre-mRNA probíhají na chromatinu ve stejný čas a na stejném místě. Tento fakt vedl k myšlence, že jsou tyto procesy regulačně spřaženy, o čemž svědčí i stále přibývající množství důkazů. Jedním z faktorů, který by toto spřažení mohl zprostředkovat, je protein Prp45/SKIP. O lidském proteinu SKIP je známo, že se účastní vzniku mRNA na úrovni iniciace i elongace transkripce, interaguje s modifikátory chromatinu a je to i známý sestřihový faktor. Funkce orthologa proteinu SKIP z kvasinky Saccharomyces cerevisiae, Prp45, byla však zatím spojena pouze se sestřihem pre- mRNA. V této práci jsme blíže charakterizovali roli Prp45 při sestřihu a také jsme rozpracovali výsledky spojující Prp45 s transkripcí a modifikacemi chromatinu. Na základě výsledků získaných metodou RNA-seq bylo zjištěno, že buňky prp45(1-169) akumulují pre-mRNA. Tato akumulace zřejmě není způsobená poškozením drah regulujících degradaci RNA. Rozsah defektů sestřihu u buněk prp45(1-169) také nebyl závislý na kánonicitě 5' sestřihového místa, místa větvení nebo vzdálenosti mezi místem větvení a 3' sestřihovým místem. Pomocí chromatinové imunoprecipitace jsme zjistili, že mutace prp45(1-169) způsobuje defekt při sestavování spliceosomu, a to ve fázi vyvazování U2 snRNP,...
|
|
|
Regulace iniciace translace u kvasinky Saccharomyces cerevisiae
Mašek, Tomáš ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
IV. Shrnutí výsledků 63 64 Denaturační RNA elektroforéza v TAE agarózových gelech 60% koncentrace formamidu postačuje k dostatečné denaturaci RNA pro elektroforetickou separaci. Denaturační RNA elektroforéza v TAE pufru vykazuje stejné separační rozlišení RNA molekul jako nejčastěji používaná RNA elektroforéza v MOPSovém pufru a navíc je rychlejší. Denaturační RNA elektroforéza v TAE pufru je použitelná nejen k separaci čisté směsi RNA molekul, ale i směsných vzorků obsahujících také DNA a proteiny (např. buněčných lyzátů). Denaturační RNA elektroforézu v TAE pufru lze kombinovat s kapilárním přenosem a následnou hybridizací (pro blotování lze použít jak konveční 10xSSC pufr, tak levnější 8 mM NaOH). Tento elektroforetický protokol poskytuje levnější a rychlejší alternativu k RNA elektroforéze v MOPSovém pufru, snižuje expozici laboratorních pracovníků toxickým látkám a je vhodný i pro laboratoře, které s RNA běžně nepracují. Rck2 se zapojuje do reprogramování ribozómů během oxidativního stresu Oxidativní stres inhibuje translaci stejnou měrou jako stres osmotický. Lze pozorovat pokles množství aktivně translatujících ribozómů. Tento pokles je proporcionální ke zvětšení ploch 40S, 60S a 80S "vrcholů" v polyzomálním profilu. Aplikace t-BOOH vede k vyšší disociaci polyzomálních komplexů u rck2Δ...
|
|
|
Role signální dráhy HOG MAPK při osmotickém stresu u Saccharomyces cerevisiae
Vrbová, Michaela ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
THE ROLE OF HOG MAPK SIGNALING PATHWAY DURING OSMOTIC STRESS IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells utilize a conserved mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling cascade (the high- osmolarity glycerol or HOG pathway) during conditions of increased external osmolarity. It evokes cellular responses necessary to permit continued growth. Activation of HOG pathway with Hog1 MAP kinase results in production of glycerol to prevent dehydration and up regulation of other Hog1 dependent genes because of cell adaptation. We were trying to find difference in translation between wild-type cells and two mutants of hog1 gene before and after 0,4 M NaCl osmotic stress (2, 6, 30 min). We used deletion mutant hog1Δ and hog1-as mutant with point mutation which allows inhibition of Hog1 MAPK during presence of specific AS inhibitor. We tested AS inhibitor by plate test and have found optimal concentration of 5 μM for blocking Hog1 MAPK in hog1-as mutant. Translation profiling proves that osmotic stress decreases translation in general. Hog1Δ mutant and hog1-as AS inhibited mutant behave similarly and their translation recovers slower than the wild-type's. That confirms that HOG1 gene is important for cell recovery from the osmotic stress. Microarray analysis shows that Hog1 dependent...
|
|
|
Interactome of the translation initiation factor eIF4E2
Lettrich, Patrik ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Zeman, Jakub (oponent)
Regulácia expresie génov na úrovni translácie je jedným z najvýznamnejších procesov pre udržanie životných funkcií buniek vo fyziologickej norme. Obzvlášť dôležitú úlohu v regulácii translácie hrá jej iniciačná fáza. Väčšina eukaryotických mRNA obsahuje na svojom 5' konci metylguanozínovú čiapočku. Naviazanie iniciačného faktoru eIF4E1 na čiapočku je podstatnou súčasťou kanonického mechanizmu iniciácie translácie. eIF4E1 je zložkou väčšieho komplexu nazvaného eIF4F, ktorého asociácia s čiapočkou mRNA je nevyhnutná pre kanonickú iniciáciu translácie. Vďaka schopnosti nekanonických iniciačných faktorov viazať čiapočku a súčasne interagovať s proteínmi odlišujúcimi sa od interakčných partnerov eIF4E1, môže dochádzať ku špecifickej regulácii translačnej iniciácie. Jedným z týchto nekanonických faktorov je eIF4E2. V regulačných procesoch vystupuje predovšetkým ako translačný represor. Naviazanie eIF4E2 na čiapočku zabráni asociácii komplexu eIF4F s mRNA a inhibuje tak transláciu. Avšak, eIF4E2 je taktiež schopný sprostredkovať iniciáciu translácie závislej na čiapočke alternatívnym mechanizmom v hypoxických podmienkach. Táto práca predstavuje prvú komplexnú analýzu proteín-proteínových interakcií a fyziologických funkcií faktoru eIF4E2 a jeho homológov u niekoľkých modelových organizmov. Kľúčové slová:...
|
|
|
Inhibitory eukaryotního translačního iniciačního faktoru eIF4E1
Pospíšilová, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Roithová, Adriana (oponent)
Syntéza proteinů je jedním z nejdůležitějších procesů, které v buňce probíhají. Proto v buňce existují nejrůznější mechanismy, které ji regulují. Pokud tato regulace selže, může dojít k rozvoji závažných patologií. Příkladem je abnormální nárůst produkce eukaryotního translačního iniciačního faktoru 4E1, ke kterému dochází v některých typech nádorů, mezi něž patří například spinocelulární karcinom hlavy a krku, kolorektální karcinom, cervikální karcinom nebo karcinom plic. Zvýšená dostupnost faktoru 4E1 umožňuje, aby v transformovaných buňkách probíhala intenzivnější translace. Exprese jednotlivých proteinů ovšem není navýšena stejnou měrou. Mnohem významnější vliv má nárůst hladiny faktoru 4E1 na proteiny onkogenní. Nádorové transformaci způsobené chybnou regulací faktoru 4E1 lze zabránit aplikací látek, které aktivitu faktoru 4E1 utlumují. Předmětem této práce je shrnutí poznatků o inhibitorech faktoru 4E1.
|
|
| |
host ::
RSS.