|
|
Controlled Production and Degradation of Selected Biomaterials
Obruča, Stanislav ; Demnerová, Kateřina (oponent) ; Vávrová, Milada (oponent) ; Němec, Miroslav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Proposed dissertation thesis is aimed at the study of production and degradation of polymeric materials using microorganisms. The main attention is given to polyesters of bacterial origin - polyhydroxyalkanoates. These materials are accumulated by a wide variety of bacterial strains which use polyhydroxyalkanoates as a storage of carbon, energy and reducing power. Thanks to their mechanical properties, that are similar to those of traditional synthetic plastics such as polyethelene or polypropylene, and thanks to their biodegradability, polyhydroxyalkanoates are considered to be environmental-friendly alternative to traditional plastics of petrochemical origin. Thus, polyhydroxyalkanoates have many potential applications in industry, agriculture as well as in medicine. Important part of this thesis is focused on production of polyhydroxyalknotes from waste substrates coming from food industry. Among tested substrates was waste cheese whey or waste plant edible oils of different origin. Utilization of cheap waste substrates for polyhydroxyalkanoates production could facilitate economically feasible process of large scale production of polyhydroxyalkanoates. According to the results presented in this thesis, waste oils are very promising substrates for biotechnological production of polyhydroxyalkanoates. Next part of the thesis deals with involvement of polyhydroxyalkanoates into stress response of bacteria. It was observed, that exposition of bacterial culture to controlled dose of ethanol or hydrogen peroxide resulted in significantly enhanced yields (abut 30 %). After stress factors application, particular metabolic pathways involved in stress response were activated in order to endure stress conditions. Subsequently, NAD(P)H/NAD(P)+ ratio increased and, thus, Krebs cycle was partially inhibited whereas polyhydroxyalkanoates synthetic pathway was activated. Moreover, application of stress factors increased molecular weights of polymers. Therefore, strategy based on application of controlled dose of stress not only enhanced polymer yields, but, moreover, improved properties of materials. The last part of thesis describes the investigation of biodegradation of polyurethane elastomeric films modified by various biopolymers in presence of mixed thermophillic culture as a model of natural bacterial consortium. The presence of materials in cultivation medium resulted in delayed but intensive growth of bacterial culture. The unusually long lag-phase was caused by release of un-reacted polyether polyol and tin catalyst from materials. The main part of material degradation was caused by abiotic degradation of elastomeric films, nevertheless, also bacterial culture slightly contributed to material decomposition. The measure of biotic degradation strongly depended on type of used modification agent. The highest tendency to undergo biotic degradation was observed for elastomeric film modified by acetylated cellulose.
|
|
|
Mechanismus plastifikace polyhydroxyalkonátů v mikrobiálních buňkách – inspirace pro vývoj artificiálních nosičových systémů
Liczka, Jan ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Diplomová práce je zaměřena na studium mechanismu plastifikace polyhydroxyalkanoátů (PHA) in vivo, přičemž se soustředí především na metody izolace nativních PHA granulí a fyzikální, resp. chemické metody iniciace jejich fázových přechodů. V práci zpracovaná Literární rešerše pojednává o tomto mikrobiálním polyesteru a dále se zaměřuje na jednotlivé metody izolace PHA z bakteriálních buněk. Hlavní náplní experimentální práce byla optimalizace postupu izolace nativních PHA granulí, a dále návrh a testování postupů, které iniciují krystalizaci PHA v izolovaných granulích, a také analytických postupů, jak tento fázový přechod korektně detekovat. Izolace PHA granulí z bakterií Cupriavidus necator se prováděla pomocí enzymů, několikanásobného odstředění a rozrušením buněk ultrazvukem. K detekci krystalizace PHA se používala infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) a enzymatická metoda, při níž je amorfní PHA selektivně degradováno PHA-depolymerázou s turbidimetrickou detekcí jeho úbytku v disperzi. V rámci podrobnějšího studia mechanismu plastifikace PHA v granulích byly využity techniky založené na fluorescenčním barvení granulí (fluorescenční spektroskopie a průtoková cytometrie). Výsledky provedených analýz mimo jiné potvrdily, že optimalizovaným postupem je možné izolovat granule v amorfním stavu, které zůstávají amorfní i po vysušení a jsou svými základními fyzikálně-chemickými vlastnostmi srovnatelné s nativními granulemi.
|
|
|
Využití moučných červů (Tenebrio molitor) k isolaci polyhydroxyalkanoátů z bakteriálních biomas a současné produkci potravin
Najbrtová, Johana ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá využitím moučného červa (Tenebrio molitor) k izolaci polyhydroxyalkanoátů z bakteriálních biomas a současné produkci potravin. Bakterie Cupravidus necator H16 a Schlegelella thermodepolymerans byly použity k přípravě polyhydroxyalkanoáty (PHA) obsahující bakteriální biomasy. V rámci práce byla zjišťována schopnost moučných červů izolovat PHA z bakteriální biomasy různých typů. Nejprve byl zjištěn obsah PHA a hrubých bílkovin v jednotlivých typech biomasy. Následně byly provedeny dva pokusy biologické izolace, v obou případech byly výsledky porovnány s kontrolním vzorkem, který konzumoval otruby. Sledována byla konverze krmiva do formy fekálních pelet, kde nejlepší výsledky měl vzorek moučných červů krmených sušenou biomasou C. necator H16. Dále byl hodnocen úbytek hmotnosti za dobu pokusu, procento přeživších, množství nezkonzumovaného krmiva a počet zakuklených jedinců. Fekální pelety získané biologickou izolací měly nízký obsah PHA, a proto byly podrobeny přečištění. Činidlo s nejlepšími výsledky bylo 0,1 M NaOH. Další částí této práce bylo určit obsah hrubých bílkovin v červí moučce vyrobené z moučných červů z pokusu dvě. Nejvyšší zastoupení bílkovin měl vzorek krmený biomasou vyprodukovanou bakterií Schlegelella thermodepolymerans.
|
|
|
Polyhydroxyalkanoáty jako metabolity prokaryot adaptovaných na extrémní prostředí
Vodička, Juraj ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem této práce je studium polyhydroxyalkanoátů jako zásobních bakteriálních zdrojů uhlíku a energie produkovaných intracelulárně. Teoretická část práce je zaměřena na vlastnosti PHA, jejich biotechnologickou produkci a degradaci. Experimentální část bakalářské práce se zabývá produkcí polyhydroxyalkanoátů pomocí halofilní bakterie Halomonas organivorans využitím různých uhlíkatých substrátů. V úvodu byl úspěšně amplifikován a detekován gen phaC kódující PHA-syntázu. Potvrzena byla také extracelulární lipolytická aktivita zkoumaného kmene. Nejvhodnějšími substráty pro růst a produkci PHB byly shledány sacharidy, konkrétně nejlepší výsledky prokázala galaktóza a manóza. Z toho důvodu je velice vhodné využití kávové sedliny pro biotechnologickou produkci PHB, jako odpadu bohatého na galaktomanany. Na druhé straně byl zaznamenán velmi omezený nebo žádný růst na laktóze a xylóze, a z toho důvodu jsou odpadní syrovátka a lignocelulózové materiály bohaté na pentózy nevhodnými substráty pro požadovaný účel. Naopak se objevuje potenciální využití odpadní melasy kvůli dobrým výsledkům ultivace na sacharóze. Pomalý růst a snížená produkce byly zjištěny při kultivaci bakterií na kuchyňském odpadu a odpadním glycerolu. Koncentrace soli vhodná pro růst H. organivorans a produkci PHB byla optimalizovaná na hodnotu 60 g/l. Přídavek vybraných prekurzorů 3-hydroxyvalerátu po 24 hodinách kultivace nepomohl k tvorbě kopolymeru P(3HB-co-3HV). Sice tento přídavek zpomalil růst, ale zvýšil procentuální tvorbu PHB v buňkách. Obecně byly výtěžky biotechnologické produkce PHB vysoké, téměř ve všech úspěšných případech byl procentuální obsah PHB v buňkách větší než 50 %. S ohledem na výsledky lze konstatovat, že k úplnému zhodnocení H. organivorans jako potenciálního biotechnologického producenta jsou žádoucí další experimenty.
|
|
|
Vývoj minibioreaktoru pro mikrobiální biotechnologie
Jakešová, Michaela ; Szotkowski, Martin (oponent) ; Krejčí,, Jan (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá vývojem minibioreaktoru pro mikrobiální biotechnologie. Výchozí jednotkou nového zařízení byl systém AlgaTox – analytický fotobioreaktor firmy BVT Technologies. Pracovní objem nového minibioreaktoru se pohybuje v rozmezí 4 až 8 ml. Minibioreaktor byl sestaven z minitermostatu, reakční nádoby, kyslíkové elektrody, teplotní a pH sondy, příslušenství pro přívod vzduchu do kapaliny a vsuvky pro transport kapaliny z/do reaktoru. Byla ověřena funkčnost sestaveného zařízení a proměřeny jeho charakteristiky. Dále byl pro vyvíjené zařízení zpracován operační postup dekontaminačního procesu využitím mlhy peroxidu vodíku. Rovněž byl sestaven operační postup pro kultivace mikroorganismů v minibioreaktoru. V připraveném zařízení byly provedeny pilotní kultivace bakterie Halomonas halophila. Při těchto kultivacích byly otestovány tři sestavy pro přívod vzduchu do kapaliny. Žádná ze sestav však nebyla schopna zajistit buněčné kultuře dostatečný přísun kyslíku – hodnota rozpuštěného kyslíku vždy klesla na 0 %. Pro následující vývoj byla navržena nová sestava pro přívod vzduchu do kapaliny – aerační věnec z membránové trubice.
|
|
|
Fotoprotektivní vlastností PHB granulí
Hesko, Ondrej ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Cílem práce je studium a návrh fyzikálně-chemické metody na ověření fotoprotektivních vlastností PHB granulí pomocí bakterie Cupriavidus necator H16 a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 lišíci se schopností produkce polyhydroxyalkanoátů. V teoretické části jsou zpracované základní informace ku polymerním agregátů a metodám využitých při zkoumaní fotoprotektivity. Byli optimalizovány metody jako nefelometrie a kontinuální fluorescenční mikrofotolýza (CFM) sloužíci k charakterizaci mechanizmu způsobu interakce světla s granulemi. V experimentální časti byly stanovovány rozptylové vlastnosti bakterií a získány charakteristické křivky. Dále byla porovnávána fotostabilita fluorescenční sondy specifická pro nukleové kyseliny v bakteriích. Tato metoda měla dokázat větší odolnost vůči UV světlu kmenu H16. Zadefinovala také možnou interakci nukleových kyselin a zkoumaných granulí.
|
|
|
Influence of oxidative pressure on bacterial cells
Dugová, Hana ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with the impact of oxidative pressure on the bacterial strain Cupriavidus necator in its two forms: Cupriavidus necator H16 producing PHB granules and Cupriavidus necator PHB-4 as a mutant that is not capable of producing granules. The thesis compares different influences causing oxidative stress that is demonstrated by the occurrence of ROS in the cell. Furthermore, the cells were analysed with a flow cytometer and a fluorescence microscope. During the analysis it was necessary to use different types of fluorescence probes. The oxidative stress was created by means of hydrogen peroxide at various concentrations. Further tests focused on Fenton’s reaction including ammonium iron sulfate and cobalt chloride hexahydrate. Propidium iodide as a fluorescence probe was used to determine the viability of the bacterial cells, and BODIPY was tested as a lipophilic dye. Finally, the ROS in the cell was detected by H2DCFDA and CM–H2DCFDA, fluorescence probes that had to be optimised for the respective technique. The result of this bachelor thesis is the confirmation of the hypothesis that PHA granules production increase the resistance of Cupriavidus necator against oxidative stress.
|
|
|
Studium produkce PHA u extremofilnich zástupců rodu Bacillus a příbuzných rodů
Reinohová, Nikola ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce je zaměřena na studium produkce polyhydroxyalkanoátů pomocí extremofilních zástupců rodu Bacillus a příbuzných rodů. V rámci práce byly zkoumány jak sbírkové mikroorganismy Ureibacillus composti DSM 171951, Alkalibacillus haloalkaliphilus DSM 5271, Alicyclobacillus acidocaldarius DSM 446, Halobacillus halophilus CCM 3527, Thermobacillus composti DSM 18247 a Bacillus licheniformis CCM 2206, tak i izolované mikroorganismy z přírodních zdrojů Aneurinibacillus thermoaerophilus LK7, Aneurinibacillus thermoaerophilus F109, Aneurinibacillus thermoaerophilus AFn2, Geobacillus thermodenitrificans F101, Geobacillus thermodenitrificans F102, Geobacillus stearothermophilus A12 a Geobacillus sp. AH11.V teoretické části jsou popsány extremofilní mikroorganismy, polyhydroxyalkanoáty a jejich využití. V experimentální části byla provedena detekce produkce PHA na úrovni genotypu pomocí metody PCR, kde byla zjišťována přítomnost PHA syntáz první a čtvrté třídy pro určité zástupce a taktéž přítomnost genu 16SrRNA. Dále byla testována produkce PHA na úrovni fenotypu, kde se testovala utilizace různých uhlíkových zdrojů a schopnost mikroorganismů tvořit s různými prekurzory kopolymery 4HB a 3HV při různých teplotách. Kopolymery jsou velice zajímavé svými vlastnostmi, díky kterým mají širokou škálu využití. Jako nejlepším zástupcem se pro produkci PHA v této práci ukázal mikroorganismus Aneurinibacillus thermoaerophilus AFn2 s produkcí PHA až 1,99 g/l a kopolymeru 3HV až 0,49 g/l.
|
|
|
Vliv magnetického pole a dalších vybraných stresorů na fyziologii mikrobiálních buněk
Mrázová, Kateřina ; Mravec, Filip (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá vlivem magnetického pole a organických látek, konkrétně benzenu a p-nitrofenolu, na buňky PHA produkující bakterie Cupriavidus necator H16 a mutantního kmene Cupriavidus necator PHB4, který polyhydroxyalkanoáty neprodukuje. Stacionární magnetické pole bylo vytvářeno jak pomocí permanentního magnetu, tak elektromagnetem. Vliv magnetického pole na růst buněk byl studován stanovením růstových křivek, kdy bylo zjištěno, že kultivace v magnetickém poli a minerálním médiu převážně inhibuje bakteriální růst. Dále byl sledován obsah polyhydroxyalkanoátů pomocí FT-IR, průtokové cytometrie a mikroskopie s fluorescenční sondou. Růstové křivky a průtoková cytometrie byly také použity pro studium působení organických látek na bakteriální buňky, kdy bylo zjištěno, že zatímco benzen C. necator H16 i C. necator PHB4 neovlivňuje, p-nitrofenol působí jako inhibitor růstu na oba typy kultur. V neposlední řadě byl pomocí plynové chromatografie studován efekt p-nitrofenolu na tvorbu PHA.
|
|
|
Incorporation of microbial cells in hydrogel carriers
Orišková, Sofia ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
The presented diploma thesis focuses on the use of plant growth promoting bacteria as an ecological alternative to conventional fertilizers. The incorporation of bacterial cells into hydrogel carriers is already a well-studied topic, but due to its disadvantages it has not yet found wider application in agriculture. This work offers a novel concept of encapsulating bacteria by gelation directly from the culture. This is achieved by crosslinking the bacterial alginate produced by the model microorganism Azotobacter vinelandii. Since this process was not described before, first its optimization was needed. Alginate production was determined gravimetrically, and its parameters were further characterized using available analytical methods – infrared spectroscopy to monitor structural parameters (monomer composition and the extent of acetylation), dynamic light scattering to characterize the size distribution and AF4-MALS-dRI to obtain the molecular weight. Bacterial PHB production was also investigated using gas chromatography and infrared spectroscopy. The second part of the work is focused on the optimization of the gelling process using bacterial alginate from the culture and CaCl2 as a crosslinking agent. Rheological experiments were used as a tool in understanding the viscoelastic properties of the prepared gels. Gelation was demonstrated within the first day after inoculation. Maximum production of alginate (1,9 ± 0,3) g/l was reached on the fourth day after inoculation. It was found that the addition of 5 g/l of calcium carbonate promotes the production of alginate. Nevertheless, further addition of CaCO3 (30 g/l) showed adverse effects on the molecular weight and is therefore not recommended. Production of PHB was confirmed by both FTIR and GC measurements, with a maximum yield of (23 ± 3) % CDW. Rheological testing confirmed that the product of the crosslinking was a gel. It was found that the crosslinker concentration plays an important role at time 0 min of the gelation, forming a denser network in the structure and causing higher rigidity. Using the highest studied concentration of CaCl2, the critical strain reached values of (5,0 ± 0,7) %. Finally, the incorporation of bacterial cells into the hydrogel was confirmed using fluorescence microscope.
|
host ::
RSS.