|
|
Utilization of physicochemical and spectroscopic techniques in study of stress-response of cyanobacteria
Skoryk, Maksym ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor's thesis focuses on observation of cyanobacteria exposed to osmotic-up and down stresses. Based on literature review appropriate methods have been proposed to study two model organisms - Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis sp. salina Wislouch CCALA 192. Four methods have been utilized to characterize osmotically stressed cyanobacteria. Flow cytometry has been utilized to assess viability of bacteria. SYTOX Blue fluorescent stain provided reliable information on bacteria stress resistance, whilst when stained with propidium iodide obscured results were obtained. Optical properties of cyanobacteria have been characterized with UV-VIS absorbance and turbidity measurements. Bacteria have undergone thermogravimetric analysis upon stress exposure to estimate cell volume dependence on extent of salt stress. This analysis suggested that PHB-positive Synechocystis sp. PCC 6803 tend to be more endurable to osmotic up-stress than PHB-negative. Gas chromatography showed PHB-positive cells to contain 1-2 % of PHB per dry cell mass.
|
|
|
Identifikace a izolace PHA produkujících bakterií
Pernicová, Iva ; Ondrejovič, Miroslav (oponent) ; Rychtera, Mojmír (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou mikrobiální zásobní polyestery, které mohou představovat obnovitelnou a ekologicky šetrnou alternativu k petrochemickým plastům. Jejich výroba a využití jsou do velké míry znevýhodněny vysokou produkční cenou. Jednou z možností, jak snížit cenu produkce PHA, je využití extrémofilních PHA producentů, které s sebou přináší především výhody vyplývající z vysoké robustnosti procesu vůči mikrobiální kontaminaci. V předložené práci byla pozornost zaměřena na studium produkce PHA pomocí vybraných halofilních a termofilních mikroorganismů. Z halofilních mikroorganismů byly testováni především vybraní sbírkoví zástupci rodu Halomonas, a to vzhledem k jejich možnému využití k produkci PHA z levného odpadního fritovacího oleje. Byli identifikováni dva slibní PHA producenti, a to konkrétně Halomonas hydrothermalis a Halomonas neptunia. Oba kmeny dosahovaly v rámci baňkových experimentů solidních výtěžků PHA a při přídavku vhodných strukturních prekurzorů byly také schopny produkce kopolymerů se zajímavými materiálovými vlastnostmi. Hlavní důraz byl však v práci kladen na studium produkce PHA pomocí termofilních mikroorganismů. V rámci práce byla provedena izolace termofilních PHA producentů z různých termofilních konsorcií (aktivní kal, kompost atd.). V průběhu izolačních experimentů byl navržen originální izolační postup využívající změny osmotického tlaku tzv. osmoselekce. Touto originální cestou bylo získáno několik desítek slibných termofilních producentů PHA, kteří byli taxonomicky zařazeni pomocí sekvenace genu 16S rRNA a byl u nich testován PHA produkční potenciál. Nejslibnějším PHA producentem byl izolát klasifikovaný jako Aneurinibacillus sp. H1. K produkci PHA pomocí Aneurinibacillus sp. H1 lze využít řadu substrátů včetně odpadního glycerolu. Ještě významnější je schopnost syntetizovat kopolymery s vysokým obsahem 4-hydroxybutyrátu. Monomerní složení PHA kopolymeru, a tím i materiálové vlastnosti připraveného kopolymeru, je možné kontrolovat vhodným nastavením kultivačních podmínek. Připravený kopolymer P(3HB-co-4HB) má unikátní vlastnosti a velký aplikační potenciál v řadě high-end aplikací například v oblasti péče o zdraví, potravinářství nebo kosmetice.
|
|
|
Využití techniky AFM při studiu biologických vzorků
Khýrová, Markéta ; Smilek, Jiří (oponent) ; Slaninová, Eva (vedoucí práce)
Předmětem bakalářské práce bylo studium Gram-negativních bakterií se schopností akumulovat polyhydroxyalkanoáty pomocí mikroskopie atomárních sil. V rámci experimentální části práce byly zkoumány bakteriální kmeny Cupriavidus necator H16 a jeho mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4, Rhodospirillum rubrum a Halomonas halophila. Konkrétním cílem bylo optimalizovat tuto mikroskopickou metodu pro výzkum jak bakterií na vzduchu, tak živých bakterií v jejich přirozeném prostředí. Optimalizace byla provedena s ohledem na jednoduchost, časovou náročnost a reprodukovatelnost provedení měření. Pro měření na vzduchu byla zvolena imobilizace 10× zředěné bakteriální suspenze vysušením na skleněném substrátu. Skenování bylo provedeno pomocí hrotu TESPA-V2 se sníženou konstantou tuhosti v QITM módu. V rámci měření bakteriálních vzorků v kapalině byly zkoumány různé postupy imobilizace bakterií na skleněném substrátu pomocí Poly-L-lysinu a Poly(ethyleniminu). Jako nejvhodnější fixace byla zvolena metoda s využitím Poly-L-lysinu. Pro měření v QITM módu v kapalném prostředí byly voleny hroty MLCT – A nebo SNL – B s konstantou tuhosti okolo 0,1 N/m. Nakonec byl proveden pokus o zisk informací o adhezi a Youngově modulu vysušených i živých bakterií s ohledem na předpokládané ovlivnění mechanických vlastností buněk s rozdílným obsahem polyhydroxybutyrátu u bakteriálních kmenů Cupriavidus necator H16 a Cupriavidus necator PHB-4.
|
|
|
Metody stanovení obsahu polyhydroxyalkanoátů v bakteriálních buňkách
Černayová, Diana ; Enev, Vojtěch (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Táto bakalárska práca sa zaoberá metódami na stanovenie polyhydroxyalkanoátov (PHA) v bunkách baktérie Cupriavidus necator H16. Medzi použité metódy patrí infračervnená spektroskopia s Fourierovou transformáciou (FTIR), Ramanova spektroskopia, turbidimetria a termické analýzy (termogravimetrická analýza a diferenčná skenovacia kalorimetria). Výsledky z metód boli porovnávané s obsahom PHA stanoveného plynovou chromatografiou. Pri infračervenej spektroskopií s Fourierovou transformáciou a Ramanovej spektroskopií sa zistila pozitívna korelácia pomeru charakteristických pásov k obsahu PHA. S použitím FTIR bolo možné okrem kvantitatívneho stanovenia PHA zistiť aj kvalitu vzorky (kryštalickosť /amorfnosť). Ďalej sa použila turbidimetrická analýza, pri ktorej sa sledovala závislosť rozptylu UV-VIS žiarenia na obsahu PHA v bakteriálnych bunkách. Najefektívnejšou technikou sa ukázala byť termogravimetrická analýza. Závislosť úbytku hmotnosti v oblasti spaľovania PHA, na jeho obsahu (zisteného plynovou chromatografiou) bola stanovená s najvyššou koreláciou k plynovej chromatografií. Metóda DSC sa neukázala byť vhodnou alternatívnou náhradou na stanovenie obsahu PHA, ale umožnila stanoviť či sa polymér nachádza v stave kryštalickom, alebo amorfnom.
|
|
|
Complementary analysis of procaryotic cells by electron microscopy and Raman spectroscopy
Ikrényiová, Terézia ; Sedláček, Petr (oponent) ; Hrubanová, Kamila (vedoucí práce)
This master thesis deals with conventional methods of bacterial cell analysis, polyhydroxyalkanoates, Raman spectroscopy and electron microscopy in the theoretical part. The production of polyhydroxybutyrate by selected thermophilic bacteria and their analysis by gas chromatography, cryogenic scanning electron microscopy and Raman spectroscopy is described in the experimental part. The chosen sample was analyzed by a transmission electron microscope. Comparing the results from previous mentioned methods it was found that the bacteria Schlegelella thermodepolymerans accumulated the highest amount of PHB. The lowest amount of PHB was obtained by bacteria Rubrobacter xylanophilus. The assumption that the PHB granules formed so-called needle-like plastic deformations during freeze-fracturing was affirmed by cryo-SEM photos analysis. Moreover, it was found that the bacterial cell characterization deduced from microscopic observation of samples corresponded to the description in the literature. TEM provided better resolution photos and in consequence the cells and PHB are more visible. The thesis is also focused on chemical fingerprint analysis of cells by Raman spectroscopy. Several biomolecules were identified by measured Raman spectra for the particular samples.
|
|
|
Krystalizace mikrobiálních polyesterů – metody studia, biologické konsekvence
Liczka, Jan ; Kalina, Michal (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Cílem bakalářské práce bylo otestovat vhodné metody přípravy amorfní formy mikrobiálních polyesterů a realizovat modelový experiment pro studium kinetiky krystalizace připravených forem polyesterů. V teoretické části je zpracována charakteristika PHA a různé metody izolace PHB granulí z bakteriálních buněk. V experimentální části byly nejprve otestovány měřící techniky jako analytická centrifugace, dynamický rozptyl světla (DLS) a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) sloužící k charakterizaci vlastností PHB granulí. Dále byl proveden experiment o izolaci nativních PHB granulí z bakterií Cupriavidus necator pomocí lysozymu, deoxyribonukleázy a rozrušením buněk ultrazvukem. Výsledky analýz ukázaly, že granule jsou buďto izolovány amorfní jen za mokra a po vysušení krystalizují, nebo že byly granule zcela amorfní, ale nedošlo k jejich dokonalé izolaci z bakteriální buňky.
|
|
|
Stresová odolnost bakteriálních monokultur a směsných kultur
Chorvátová, Michaela ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
V tejto bakalárskej práci bola skúmaná stresová odolnosť bakteriálnych monokultúr a definovanej zmiešanej kultúry. Teoretickú časť predstavuje literárna rešerš, ktorá sa zaoberá všeobecnou stresovou odolnosťou baktérií a dynamikou ich rastu. Ďalej sú predstavené polyhydroxyalkanoáty, ich zapojenie do stresovej odpovede baktérií a významná moderná metóda akou je prietoková cytometria, ktorá predstavovala dôležitú súčasť experimentu. V experimentálnej časti bola študovaná odolnosť voči osmotickému a teplotnému stresu. Pre tento účel boli použité monokultúry PHA akumulujúceho kmeňa Cupriavidus necator H16 a mutantného kmeňa Cupriavidus necator H16/PHB-4 neschopného akumulácie PHA. Definovaná zmiešaná kultúra bola pripravená kokultiváciou týchto dvoch kmeňov. Celkovo možno konštatovať, že akumulácia a utilizácia PHA, konkrétne poly(3-hydroxybutyrátu), zvýšila odolnosť baktérií, čo sa najviac prejavilo u osmotického stresu, kedy koncentrácie soli nespôsobili výraznejšie zníženie viability u Cupriavidus necator H16 oproti mutantnému kmeňu, ktorého viabilita klesala s rastúcou intenzitou stresu. Experimentálne teploty naopak nepredstavovali výrazný vplyv na viabilitu buniek, pričom sa takmer vždy potvrdilo, že baktériám sa najviac darilo pri ich teplotnom optime 30 °C.
|
|
|
Analýza bakteriálních buněk pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie
Müllerová, Lucie ; Mravec, Filip (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi analýzy viability a obsahu polyhydroxyalkanoátů (PHA) bakteriálních buněk, a to pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. V části věnující se cytometrické analýze bakteriálních buněk byla otestována řada viabilních fluorescenčních sond, ale prakticky se osvědčily pouze dva systémy – propidium iodid a komerční BacLightTM kit, který vykazoval o něco vyšší přesnost stanovení viabilitně bakteriální kultury. Dále byla využita akridinová oranž k analýze fyziologického stavu mikrobiální kultury a dvě hydrofobní sondy, Nilská červeň a BODIPY 493/503, k analýze obsahu PHA v bakteriálních buňkách. Především sonda BODIPY 493/505 se zdá být velmi zajímavá, protože nevyžaduje permeabilizaci buněčných obalů a díky svým spektrálním vlastnostem je plně kompatibilní s propidium iodidem. Tato skutečnost otevírá možnost simultánní analýzy viability bakteriálních kultur a obsahu PHA. V části vyhodnocování mikroskopických výsledků bylo prezentováno několik fluoroforů. Bylo zjištěno, že koncentrace fluoroforů využívaná pro cytometrické analýzy je pro mikroskopii příliš vysoká. SYTO9 svítící převážně v zeleném kanále měla určitý fluorescenční signál i v červeném kanále. Vzorky obarvené BODIPY 493/503 vykazovaly vysoké intenzity fluorescence při koncentraci barviva 10 . Zároveň byly jak u obou kmenů naměřeny záporné amplitudy intenzity fluorescence, výraznější byla u C. necator H16. U tohoto kmene byl překvapivý objev vysoké koncentrace barviva především na povrchu granulí PHB, kde byla zároveň téměř nulová anisotropie barviva (volná otáčivost sondy).
|
|
|
Isolace, charakterizace a aplikace biomedicínsky významného polymeru P(3HB-co-4HB)
Krupičková, Kristýna ; Přikryl, Radek (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá izolací a charakterizací kopolymeru P(3HB-co-4HB). Teoretická část byla zpracována jako literární rešerše, která popisuje obecně polyhydroxyalkanoáty, jejich strukturu, syntézu, degradaci a izolaci. Dále jsou v práci uvedeny kopolymery obsahující 4HB jednotky a nechybí zde ani zmínka o biosyntéze a biodegradaci kopolymeru P(3HB-co-4HB). Cílem této diplomové práce bylo zjistit, které rozpouštědlo je pro extrakci kopolymeru nejlepší a následně takto vyextrahovanou fólii kopolymeru P(3HB-co-4HB) charakterizovat. Vyizolovaný kopolymer byl charakterizován pomocí plynové chromatografie, SEC-MALS termické analýzy a SEM. V druhé části práce bylo studováno uvolňování modelové biologicky aktivní látky z PHA fólie v přítomnosti různých hydrolytických enzymů. Pro simulaci bylo vybráno barvivo Rhodamin 6G, kterým byly obarveny fólie kopolymeru a fólie P(3HB). Fólie připravená z P(3HB-co-4HB) kopolymeru uvolňovala modelovou látku vyšší rychlostí než fólie z homopolymeru P(3HB), kopolymer byl také náchylnější k degradaci použitými enzymy.
|
|
|
Interakce částic a vláken na bázi PHA s lidskými buňkami
Tarageľ, Matej ; Bokrová, Jitka (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Bakalárska práca sa zaoberá optimalizáciou prípravy nanočastíc a nanovlákien na báze polyméru PHA a ich následným pôsobením na živú ľudskú kožnú bunku. Teoretická časť zahŕňa možnosti prípravy a charakterizácie nanomateriálov, predovšetkým nanočastíc na báze polyhydroxyalkanoátov spolu s ich fyzikálnymi, biologickými a chemickými vlastnosťami. Následne sú popísané metódy charakterizácie lipozómov, ich rozdelenie, príprava a vlastnosti . Ďalej sa práca zameriava na testy cytotoxicity, kultiváciu ľudských buniek a všeobecné k vybraným bunkovým líniám. Praktická časť sa už zaoberá samotnou optimalizáciou prípravy lipozómových častíc a vlákien obohatených o PHA. Nasledovala ich charakterizácia a sledovanie dlhodobej stability a interakcie týchto nanomateriálov s živými HaCaT bunkami. Boli prevedené a vyhodnotené cytotoxické a genotoxické testy spolu so stanovením zvyškových fosfolipidov.
|
host ::
RSS.