|
|
Analýza miRNA u nádorů asociovaných s lidskými papilomaviry
Pagáčová, Lucie ; Tachezy, Ruth (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Papilomaviry jsou malé DNA viry, které jsou spojovány s indukcí epiteliálních nádorů. HPV je známý jako infekční agens způsobující téměř 100 % nádorů cervixu, ale může být též původcem karcinomů v dalších místech anogenitálního traktu či nádorů hlavy a krku mužů i žen. Aktivní infekce HPV navozuje změny exprese miRNA, které mohou dále přispívat ke vzniku a progresi nádorů. Je již známo, že papilomaviry nekódují své vlastní virové miRNA, ale mohou ovlivňovat expresi buněčných miRNA. V této diplomové práci jsem u vybraných typů epiteliálních nádorů (vulvy, cervixu, anu a tonsil) určila jejich etiologii. Výskyt miRNA v tkáních jsem otestovala pomocí sekvenování nové generace. Ze získaných dat jsem určila expresní profily deregulovaných miRNA ve vztahu ke zdravé tkáni příslušné lokalizace. Ačkoli byl analyzován dostatečný počet vzorků, z důvodu nepřítomnosti statisticky relevantních diferenciálně exprimovaných miRNA ve vulvárních nádorech pozitivních na HPV, nebylo možné prokazatelně určit HPV-core miRNA společné pro všechny testované nádory vyvolané HPV. Mezi nádory ostatních lokalizací jsem nalezla překryv ve třech miRNA. Jedna z těchto miRNA (miR-139-5p) a dále miR-9-5p, které jsem určila na základě studia ostatních publikovaných dat, byly následně vybrané pro funkční testování in vitro. U HPV...
|
|
|
Charakterizace nekanonické RNA polymerázy kódované lineárními plasmidy kvasinek
Sýkora, Michal ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Macíčková Cahová, Hana (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Transkripce je hlavním kontrolním bodem genové exprese. Tento proces závisí na proteinovém komplexu vícepodjednotkových RNA polymeráz, které jsou mimořádně konzervované mezi všemi buněčnými organismy. U mimochromozomálních dědičných elementů, jako jsou organely, viry a plasmidy, je transkripce závislá na RNA polymerázách buněk hostitelských organismů, nebo tyto elementy kódují RNA polymerázu vlastní. Předpokládaná nekanonická RNA polymeráza, skládající se ze dvou podjednotek, je kódována také lineárními cytoplasmatickými plasmidy kvasinky Kluyveromyces lactis a velmi pravděpodobně přepisuje pouze geny těchto plasmidů. Kromě dvou podjednotek RNA polymerázy kódují lineární plasmidy Kluyveromyces lactis ještě další dvě předpokládané komponenty transkripčního aparátu, a to capping enzym přidávající čepičku na 5' konce mRNA, a předpokládanou DExD/H box helikázu. Charakterizace unikátního a nepříliš probádaného transkripčního aparátu plasmidů Kluyveromyces lactis byla hlavní náplní této práce. Cílem bylo především: 1) objasnit evoluční původ transkripčního aparátu lineárních plasmidů; 2) popsat architekturu transkripčního komplexu lineárních plasmidů in vivo se zaměřením na předpokládané vazebné partnery RNA polymerázy; 3) odhalit mechanismy iniciace a terminace transkripce kvasinkových lineárních...
|
|
|
Role RNA helikáz v antivirové obraně
Krbušek, David ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Janovec, Václav (oponent)
Virus hepatitidy typu C je významný lidský patogen, proti kterému dosud neexistuje imunizace. Po infekci je tento virus detekován imunitním systémem eukaryotické hostitelské buňky pomocí receptorů rozpoznávající molekulární vzory z rodiny RLR receptorů, které jsou součástí vrozeného imunitního systému. Tyto RLR receptory detekují přítomnost viru hepatitidy typu C a iniciují signální kaskádu spouštějící antivirovou imunitní odpověď. V této bakalářské práci je popsána a charakterizována role cytoplazmatických PRR účastnících se antivirové obrany při infekci eukaryotické buňky virem hepatitidy C. Klíčová slova helikáza, RIG-I, MDA5, pattern-recognition receptors, HCV, virus
|
|
|
Interaction of nucleic acids with RNA polymerase
Janoušková, Martina ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Knejzlík, Zdeněk (oponent)
Regulace genové exprese RNA polymerázou (RNAP) je nezbytnou schopností živých organizmů, která v konečném důsledku umožňuje jejich přežití. Interakce RNAP s nukleovými kyselinami (DNA nebo RNA) je pro transkripci a její regulaci rozhodující. Tato doktorská práce se zabývá dvěma projekty adresovanými k interakci RNAP s nukleovými kyselinami: (i) Transkripcí modifikovaných DNA templátů a (ii) Ms1, malou RNA, v M. smegmatis. (i) Zkoumali jsme vliv modifikací v malém žlábku DNA na bakteriální transkripci in vitro. Zjistili jsme, že transkripce modifikovaných DNA templátů je ovlivněna ve fázi iniciace transkripce a efekt modifikací je závislý na sekvenci promotoru. Dále jsme úspěšně provedli zapnutí a vypnutí transkripce in vitro pomocí bioortogonálních reakcí. Regulace transkripce pomocí umělých modifikací DNA má budoucnost v biotechnologiích a/nebo v medicíně. (ii) Dalšími regulátory genové exprese jsou malé nekódující RNA. Tuto důležitou roli mají tyto molekuly jak v prokaryotech, tak v eukaryotech. Ms1 je malá RNA nalezená v mykobakteriích tvořící komplex s jádrem RNAP. Ms1 se v buňkách nachází ve velkém množství ve stacionární fázi (množství Ms1 je porovnatelné s ribozomální RNA). Zkoumali jsme její syntézu a degradaci v M. smegmatis a došli jsme k závěru, že vysoké množství Ms1 ve stacionární fázi...
|
|
|
Bakteriální RNA polymeráza a molekuly ovlivňující její funkci
Jirát Matějčková, Jitka ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Staněk, David (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) přepisuje DNA do RNA a je jediným takovým enzymem provádějící transkripci u bakterií. Tento klíčový enzym rozhoduje o odpovědi buňky na vnější i vnitřní signály, rozhoduje o míře transkripce jednotlivých genů a tím reguluje genovou expresi. RNAP ovlivňují nejen vlastní podjednotky, ale i proteinové faktory, malé molekuly či malé RNA (sRNA). Cílem této disertační práce bylo přispět k poznání regulace RNAP a doplnit tak chybějící střípky do tohoto rozsáhlého tématu. Tato práce se zabývá vlivem vybraných proteinů (δ, YdeB, GreA) na citlivost RNAP vůči koncentraci iniciačního nukleosid trifosfátu ([iNTP]) při iniciaci transkripce u Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že δ zvyšuje citlivost RNAP k [iNTP] na [iNTP]-senzitivních promotorech, nikoliv však u [iNTP]-nesenzitivních promotorů in vitro ani in vivo. Podjednotka δ je zásadní při soutěži o přežití, neboť umožňuje buňce okamžitě zareagovat na změnu podmínek. Protein YdeB se neváže na RNAP v B. subtilis a zároveň neprokázal žádný viditelný efekt na transkripci in vitro. Zjistili jsme tedy, že proteiny GreA a YdeB na rozdíl od podjednotky δ nejsou schopny ovlivnit citlivost RNAP k [iNTP] u [iNTP]-senzitivních promotorů in vitro. Charakterizovali jsme nově objevenou sRNA u Mycobacterium smegmatis - Ms1, silně produkovanou ve...
|
|
|
Molekulární interakce Staphylococcus aureus s hostitelem
Cabrnochová, Marie ; Melter, Oto (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Cílem této práce je shrnout mechanizmy interakce Staphylococcus aureus s vybranými složkami vrozené imunity hostitele, z nichž k nejdůležitějším patří kolonizace hostitelské buňky a interakce S. aureus s neutrofily a procesy ovlivňující na bunečné úrovni kolonizaci hostitelské buňky. Povrchové proteiny patogena MSCRAMM interagující s proteiny na povrchu hostitelských buněk jako je například fibrinogen a keratin a tak zprostředkují adhezi k hostitelské buňce, která je podmínkou pro kolonizaci hostitelské buňky. Centrálním mechanizmem vrozené imunity vůči stafylokokové infekci je interakce S. aureus s neutrofily, které pomocí neutrofilové extracelulární pasti a fagocytózy buňky S. aureus likvidují. Zásadní roli při eliminaci bakteriální buňky ve fagozomu neutrofilů je kombinace lytického působení antimikrobiálních peptidů a produkce toxických kyslíkových radikálů. Obranné mechanizmy S. aureus proti působení imunitního systému jsou považované za faktory virulence, neboť přispívají ke vzniku infekce. Tyto mechanizmy jsou založeny na modifikací buněčné stěny, inhibicí chemotaxe neutrofilů a produkcí enzymů, které inhibují účinek antimikrobiálních peptidů, lysozymu, kyslíkových a dusíkových radikálů. Exprese těchto faktorů virulence u konkrétního kmene S. aureus a rizikové faktory na straně hostitele a...
|
|
|
Indukovatelné promotory a jejich využití pro buněčné manipulace kvasinek
Přibáňová, Gabriela ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Pro některé buněčné manipulace se dnes využívají promotory, které mohou být indukovány chemickými, nebo určitými fyzikálními faktory. Největší důraz je v této práci kladen na promotory indukovatelné světlem. Jsou dva přístupy, které nám umožňují aktivaci promotoru působením světla. První z nich využívá tzv. "caged molecules", chemických induktorů, jejichž regulační aktivita je "maskovaná" fotolabilní chránící skupinou. Druhý přístup zahrnuje optogenetické systémy, které mohou v buňkách regulovat transkripci. Tyto systémy jsou kódovány v DNA organismu, který tento systém nese, a jako jediný vnější regulační stimul potřebují světlo. Základní součástí optogenetických aparátů jsou fotoreceptory, které pro svou funkci potřebují kofaktor - chromofor. Fotoreceptory se řadí do několika funkčních skupin podle typu chromoforu a způsobu jejich fotoaktivace. Tato práce dává přehled o optogenetických systémech, využitých pro regulaci transkripce z hlediska využitého fotoreceptoru a mechanismu indukce. Stejně tak se zabývá využitím "caged molecules" pro regulaci transkripce. Dále jsou zde jmenovány případy využití těchto systémů v kvasinkách, modelového organismu využívaného ve vědě a pro biotechnologické účely. Na závěr diskutuji určitá omezení, které promotory indukovatelné světlem v některých případech...
|
|
| |
|
|
Role 5' koncových struktur u eukaryotických mRNA
Vopálenský, Václav ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Lukeš, Julius (oponent) ; Staněk, David (oponent)
73 V. SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ IRESITE: THE DATABASE OF EXPERIMENTALLY VERIFIED IRES STRUCTURES (WWW.IRESITE.ORG) IRESite je kurátorovaná relační databáze typu MySQL-4.1 využívající InnoDB tabulky. Do databáze je možné vložit položky dvojího typu: o natural položky obsahují veškerá experimentální data týkající se určité IRES struktury (kompletní sekvence mRNA s vymezením pozic IRES sekvence a kódovaného proteinu, veškeré proteiny interagující s IRES, případná sekundární struktura) o engineered položky popisují uměle vytvořené plazmidy. Většinou se jedná o bicistronní plazmidy sloužící k testování funkčnosti sekvence, o níž se předpokládá, že obsahuje IRES element, a případné mutantní deriváty této sekvence. Do IRESite se v tomto případě vkládají údaje o sekvenci mRNA s vymezením IRES oblasti, informace o reportérových proteinech, informace o translačních experimentech včetně použitého promotoru a informace o pozitivních a negativních kontrolách. V databázi je nyní uloženo 288 položek; 67 natural (20 virových a 47 buněčných) a 221 engineered. IRESite slouží nejen k ukládání experimentálních dat, ale umožňuje také jejich prohledávání podle klíčových slov, případně následné porovnávání vybraných experimentů. A BIOINFORMATICAL APPROACH TO THE ANALYSIS OF VIRAL AND CELLULAR INTERNAL RIBOSOME ENTRY Publikace...
|
|
| |
host ::
RSS.