|
|
Regulation of transcription in Gram-positive bacteria
Rabatinová, Alžběta ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Bobek, Jan (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Bakterie patří mezi nejrozšířenější organizmy na světě. Žijí ve všech prostředích, včetně těch nejextrémnějších. Všechny suchozemské a vodní ekosystémy jsou závislé na jejich aktivitě. Bakterie plní nezbytnou úlohu při recyklaci živin, jako jsou uhlík, dusík a síra. Z důvodu jejich krátkého životního cyklu se musí rychle a adekvátně přizpůsobovat podmínkám okolí. Mikrobiální růst je autokatalytický proces. Růstová křivka bakterií má tři základní fáze: lag fáze, exponenciální fáze a stacionární fáze. Bakteriální buňka musí při přechodu mezi těmito fázemi přizpůsobovat genovou expresi pro adaptaci k novým podmínkám. Prvním krokem genové exprese je transkripce. Klíčovou úlohu v tomto procesu hraje RNA polymeráza (RNAP), která přepisuje DNA do RNA. RNAP je regulována řadou dalších proteinů a taktéž malými molekulárními efektory. Abychom pochopili, jak se bakterie přizpůsobují svému okolí, musíme pochopit jak RNAP a její regulace fungují. Tato disertační práce studuje vybrané aspekty genové regulace na úrovni transkripce. Modelovým organismem je Bacillus subtilis. První část disertační práce se věnuje regulaci RNAP prostřednictvím iniciačního nukleosid trifosfátu (iNTP) a identifikuje podjednotku δ jako proteinový faktor důležitý pro tuto regulaci. Je demonstrována funkce tohoto proteinu a jeho...
|
|
|
The role of elF3 a Rps3 in stop codon readthrough
Poncová, Kristýna ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Translace představuje složitě regulovaný a vysoce provázaný proces výroby proteinů v buňce. Má několik základních fází-iniciaci, elongaci, terminaci a recyklaci ribosomů. Naše laboratoř se zabývá studiem multifaktoriálního komplexu eukaryotického iniciačního faktoru 3 (eIF3). Zajímá nás nejen odhalování jeho molekulárních rolí v průběhu translačního cyklu, ale také jeho úloha při specifických mechanismech, které se podílí na regulování translace v závislosti na buněčných potřebách. eIF3 se skládá v kvasinkách z pěti esenciálních podjednotek (a/Tif32, b/Prt1, c/Nip1, g/Tif35 a i/Tif34). V savcích je jeho složení komplexnější s 12 podjednotkami (a-i, k-m). eIF3 je klíčový hráč nejen v iniciaci translace, ale také ve fázi recyklace ribosomů a překvapivě i v translační terminaci a pročítání stop kodonu. Posledně zmiňovaný proces má velký klinický potenciál, jelikož téměř 1/3 geneticky podmíněných onemocnění je způsobena přítomností předčasného terminačního kodonu v protein kódující oblasti. Porozumění molekulárním detailům pročítání stop kodonu a translačně terminační mašinérie je důležité pro další vývoj selektivních a méně toxických léčiv vhodných k terapii. V této disertační práci jsem popsala jak protein malé ribosomální podjednotky Rps3 řídí efektivitu rozpoznávání stop kodonu. Identifikovala jsem...
|
|
|
Age-related differences in translation of mammalian oocytes
del Llano Solanas, Edgar ; Kubelka, Michal (vedoucí práce) ; Nevoral, Jan (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(česky) Samičí zárodečné buňky (známé též jako oocyty) se u savců nacházejí ve vaječnících, kde je jejich vývoj zastaven ve stádiu profáze 1. meiotického dělení (profáze I). Teprve až v průběhu puberty dochází k selekci oocytů, které následně rostou, uvolňují se z výše zmíněného profázního bloku, ovulují a stávají se pak schopnými být oplodněny a dát základ budoucímu embryu. Polovina genetické informace embrya tedy pochází přímo z oocytu a tudíž kvalita oocytu a jeho meiotického zrání hraje v reprodukci klíčovou úlohu. Jedním z faktorů, který může dramaticky snížit kvalitu oocytů u několika druhů savců je pokročilý věk samic. Jak u myší, tak u člověka se snížená kvalita oocytů pocházejících od starších matek projevuje především zvýšením výskytu chromozomální aneuploidie. Důsledkem je přítomnost nesprávného počtu chromozomů v embryo, což snižuje jeho viabilitu a může se projevit i dalšími klinickými příznaky. Práce, která je obsahem této dizertace byla primárně zaměřena na pochopení příčin zvýšeného výskytu chromozomálních aneuploidií v myších oocytech pocházejících od starších samic. Jedním z nejdůležitějších znaků, kterými se oocyty vyznačují, je to, že po překonání profázního bloku a zahájení meiotického dělení je jejich transkripční aktivita prakticky nulová a vlastní regulace průběhu meiózy je...
|
|
|
The effect of selected endogenous and exogenous factors on bacterial growth
Šiková, Michaela ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Valášek, Leoš (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Růst bakteriální kultury binárním dělením je klíčovou charakteristikou těchto organismů. Tento růst závisí na dvou typech faktorů: endogenní a exogenní. Endogenní faktory tvoří molekulární aparát buněk. Mezi důležité endogenní faktory patří rovněž ty, které se podílejí na genové expresi a její regulaci. Mezi exogenní faktory řadíme dostupnost živin, teplota, pH, různé stresy nebo přítomnost antibiotik. Hlavním cílem mé dizertační práce bylo studium vlivů vybraných endogenních a exogenních faktorů na bakteriální růst. Jako endogenní faktory jsem studovala RNázu J1 u Bacillus subtilis a malou RNA zvanou Ms1 u Mycobacterium smegmatis, které se podílejí na regulaci genové exprese na úrovni transkripce. Ukazuji zde, že RNáza J1 může, kromě své role v degradaci RNA, hrát roli v genomové integritě odstraněním zastavených komplexů RNA polymerázy (RNAP) z DNA. Dále ukazuji, že Ms1 se váže na jádro RNAP a má vliv na množství RNAP v buňce. Výsledky odhalují nové mechanistické aspekty transkripčního aparátu a ukazují, jak jednotlivé komponenty nebo kombinace ovlivňují bakteriální růst. Jako exogenní faktory jsem studovala nedávno objevené antibakteriální látky zvané lipofosfonoxiny a jejich interakci s bakteriemi, bakteriálními proteiny a vliv na bakteriální růst. Stručně řečeno, tato práce posouvá naše...
|
|
|
Role of small ribosomal proteins forming the decoding site in translation.
Hovorková, Zuzana ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Translace je jeden z klíčových mechanismů probíhajících v buňce každou sekundu po dobu celé její existence. Jde o velice složitý proces, který je zajišťován třemi hlavními aktéry: tRNA, mRNA a ribosomy. I přesto, že už studován po několik desetiletí, znalosti týkající se několika funkčních aspektů jsou stále mizivé. Tato bakalářská práce se zaměřuje na čtyři malé ribozomální proteiny vyjmenované níže, které dosahují k dekódovacímu centru malé ribozomální podjednotky. Zvyšuje povědomí o struktuře a funkci uS12, uS19, eS25 a eS30, jejich evoluci, roli v ribozomu a jejich vlivu na různé fáze translace. Konkrétně tato práce specificky zkoumá důležitost těchto čtyř ribosomálních proteinů na pročtění stop kodonu. K tomuto fenoménu dochází, když blízce příbuzná aminacylová- tRNA nebo přirozeně supresorová tRNA vyhraje s eRF1 nad příslušným stop kodonem, a tak syntéza protein pokračuje vedoucí k existence delšího protein. Shrnuje aktuální poznání jeho původu, mechanismu, existence v různých živočišných druzích, přinos i nevýhody, které buňce či dokonce organismu poskytuje, a na závěr shrnuje dostupné znalosti o potenciálním využití pročtení stop kodonu v lékařství. Klíčová slova: translace, pročtění stop kodonu, ribozom, ribozomální proteiny, uS12, uS19, eS25, eS30
|
|
|
Charakterizace nekanonické RNA polymerázy kódované lineárními plasmidy kvasinek
Sýkora, Michal ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Macíčková Cahová, Hana (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Transkripce je hlavním kontrolním bodem genové exprese. Tento proces závisí na proteinovém komplexu vícepodjednotkových RNA polymeráz, které jsou mimořádně konzervované mezi všemi buněčnými organismy. U mimochromozomálních dědičných elementů, jako jsou organely, viry a plasmidy, je transkripce závislá na RNA polymerázách buněk hostitelských organismů, nebo tyto elementy kódují RNA polymerázu vlastní. Předpokládaná nekanonická RNA polymeráza, skládající se ze dvou podjednotek, je kódována také lineárními cytoplasmatickými plasmidy kvasinky Kluyveromyces lactis a velmi pravděpodobně přepisuje pouze geny těchto plasmidů. Kromě dvou podjednotek RNA polymerázy kódují lineární plasmidy Kluyveromyces lactis ještě další dvě předpokládané komponenty transkripčního aparátu, a to capping enzym přidávající čepičku na 5' konce mRNA, a předpokládanou DExD/H box helikázu. Charakterizace unikátního a nepříliš probádaného transkripčního aparátu plasmidů Kluyveromyces lactis byla hlavní náplní této práce. Cílem bylo především: 1) objasnit evoluční původ transkripčního aparátu lineárních plasmidů; 2) popsat architekturu transkripčního komplexu lineárních plasmidů in vivo se zaměřením na předpokládané vazebné partnery RNA polymerázy; 3) odhalit mechanismy iniciace a terminace transkripce kvasinkových lineárních...
|
|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
|
|
Binding of eIF3 in complex with eIF5 and eIF1 to the 40S ribosomal subunit is accompanied by dramatic structural changes
Zeman, Jakub ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Štefl, Richard (oponent) ; Man, Petr (oponent)
Eukaryotické iniciační faktory (eIF) jsou pro průběh eukaryotické translace minimálně stejně důležité jako ribosom. Některé tyto faktory mají rozdílné úlohy napříč celou translací v zajištění korektního složení preiniciačního komplexu na mRNA, přesném výběru iniciačního kodonu, bezchybné produkci příslušného polypeptidu a jejím řádném ukončení. Patrně nejdůležitějším z těchto faktorů je eIF3, který integruje signály od ostatních faktorů a koordinuje jejich funkci na ribosomu. V případě Saccharomyces cerevisiae je eIF3 tvořen pěti podjednotkami. Všechny tyto podjednotky obsahují strukturní motivy zodpovědné za kontakt s ribosomálními proteiny a molekulami RNA. Kromě těchto vysoce strukturovaných částí je zbytek eIF3 nestrukturovaný a velmi flexibilní. Z toho důvodu nejsou i přes současný pokrok v kryoelektronové mikroskopii doposud známy ani přesná struktura eIF3, ani jeho přesná poloha na ribosomální podjednotce 40S. Rovněž přítomnost eIF3 na ribosomu 80S během časné elongace a role eIF3 v reiniciaci a pročítání stop kodonu nejsou zatím zcela prostudovány. K rozluštění těchto tajemství eIF3 jsme použili rentgenovou krystalografii, chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií a rozličné biochemické a genetické metody. Naše práce ukazuje, že je eIF3 velmi kompaktně sbalený, pokud se nachází...
|
|
|
Molecular details of translation reinitiation in budding yeast
Mohammad, Mahabub Pasha ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Eukaryotická iniciace translace je vysoce komplexní proces zahrnující celou řadu fází. Iniciace translace je zahájena sestavením preiniciačního komplexu 43S, který nasedá na 5' čepičku mRNA a následně pročítá mRNA za účelem rozpoznání vhodného AUG start kodónu. Po rozeznání AUG kodónu většina iniciačních faktorů z komplexu 48S disociuje. Některé z těchto faktorů nicméně zůstávají s komplexem 48S přechodně asociované, jedná se například o eIF3 a nejspíše o eIF4G. V rámci této práce jsme vyvinuli metodu RNA-protein Ni2+ -pull down (Rap-Nip), která slouží k in vivo detekci fragmentů mRNA navázaných na eIF3 v kvasinkách. Ukázali jsme, že eIF3 kvasinky Saccharomyces cerevisiae zůstává po iniciaci translace perzistentně navázán na elongujících ribozomech po dobu několika elongačních cyklů. eIF3 navíc stabilizuje post-terminační komplex 40S na stop kodónu krátkých čtecích rámců uORF1 a uORF2 GCN4 a to prostřednictvím kontaktu mezi N-terminální částí podjednotky a/TIF32 a elementy podporujícími reiniciaci (RPEs) příslušného uORF GCN4. S využitím β-galaktosidázového reportérového systému jsme odhalili, že AU- bohatý motiv (motiv AU1-2A/ UUAU2) nacházející se těsně za stop kodonem reiniciačně (REI)-permisivních uORFs podporuje autonomně a místně specificky reiniciaci. Rovněž jsme ukázali, že přesná délka...
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
host ::
RSS.