|
|
Oxidace ellipticinu lidskými cytochromy P450 exprimovanými v prokaryotním a eukaryotním systému
Vejvodová, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Ellipticin, protinádorový alkaloid, představuje léčivo, jehož mechanismus účinku je založen na interkalaci do DNA, inhibici topoisomerasy II a na tvorbě kovalentních aduktů s DNA prostřednictvím enzymové aktivace cytochromy P450 a/nebo peroxidasami. Ellipticin je oxidován cytochromy P450 až na pět metabolitů (7-hydroxy-, 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu). Z těchto metabolitů jsou 9-hydroxy- a 7- hydroxyellipticin považovány za detoxikační metabolity, zatímco 12-hydroxyellipticin, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu za aktivační metabolity, které jsou zodpovědné za tvorbu kovalentních aduktů s DNA. V diplomové práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotním (SupersomesTM ) a dvou prokaryotních expresních systémech (Bactosomes) v oxidaci ellipticinu. Cytochromy P450 exprimované v prokaryotních systémech se lišily v množství "koexprimované" NADPH:CYP reduktasy. Vzniklé metabolity ellipticinu byly analyzovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské cytochromy P450 CYP2C9/2D6/2C19 exprimované v prokaryotním nebo eukaryotním systému oxidují ellipticin za vzniku až čtyř metabolitů: 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13-hydroxyellipticinu and N2 -oxid ellipticinu. Jejich účinnost se ale...
|
|
|
Oxidace benzo(a)pyrenu cytochromem P450 1A1 exprimovaným v prokaryotickém a eukaryotickém systému
Kroftová, Natálie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Benzo[a]pyren (BaP) je významným lidským kancerogenem. Je metabolizován řadou enzymových systémů jako jsou cytochromy P450 (CYP) a epoxidhydrolasa. Cílem předkládané diplomové práce bylo studium metabolismu BaP in vitro jaterním mikrosomálním systémem potkanů premedikovaných induktory cytochromů P450 a dále lidským cytochromem P450 1A1 (CYP1A1) exprimovaným v eukaryotickém a prokaryotickém systému. Eukaryotický expresní systém byl tvořen mikrosomy izolovanými z hmyzích buněk, zatímco prokaryotický expresní systém tvořily "zlomky" membrán E. coli. V rámci rekombinantního lidského CYP1A1 byl zkoumán vliv cytochromu b5, NADPH:cytochrom P450 reduktasy (CPR) a epoxidhydrolasy na oxidaci BaP. Izolace a purifikace králičí jaterní CPR byla dalším cílem této práce. Metabolity vzniklé oxidací BaP byly separovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že jaterní mikrosomální systémy potkanů premedikovaných induktory CYP podrodiny 1A (Sudanem I), podrodiny 2B (fenobarbitalem) a podrodiny 3A (PCN) vykazují vyšší efektivitu oxidovat BaP než mikrosomy kontrolních potkanů. BaP je oxidován lidským CYP1A1 exprimovaným v eukaryotickém systému na šest metabolitů (BaP-9,10-dihydrodiol, metabolit BaP s dosud neurčenou strukturou, BaP-7,8-dihydrodiol, BaP-1,6-dion, BaP-3,6-dion a BaP-3-ol), zatímco...
|
|
|
Exprese a purifikace N-koncové části filamentózního hemaglutininu z Bordetella Pertussis v E. Coli
Jurnečka, David ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
: Černý kašel je vysoce nakažlivé onemocnění způsobené gramnegativní bakterií Bordetella pertussis. V průběhu infekce bakterie produkuje celou řadu toxinů a adhezivních molekul, mezi něž patří i filamentózní hemaglutinin (FHA). FHA je 220 kDa povrchový protein, jenž je také produkován ve velkém množství do média, a hraje klíčovou úlohu v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami. Cílem této práce bylo vytvořit heterologní expresní systém na produkci N-koncové části B. pertussis FHA (FHA1-862) v buňkách Escherichia coli. Pro sekreci proteinu FHA1-862 do media byl vytvořen plasmid skládající se ze systému dvou nezávislých T7/Lac promotorů, první pro gen fhaB kódující FHA1-862, a druhý pro gen fhaC kódující transportní protein, jenž umožňuje přenos FHA z periplasmatického prostoru do extracelulárního média. Protein byl úspěšně sekretován v buňkách E. coli BL21 nesoucí plasmid pMM100 (LacIq ) při 30 řC a přečištěn pomocí afinitní kapalinové chromatografie na nosiči Cellufine. Tyto výsledky naznačují, že protein FHA862 může být produkován expresním systémem E. coli, nicméně tento systém poskytuje malou výtěžnost proteinu.
|
|
|
Syntéza a biochemická charakterizace hybridních analogů lidského insulinu a IGF-2
Povalová, Anna ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Koberová, Monika (oponent)
Stále rostoucí trend výskytu nemoci diabetes mellitus neboli cukrovky naznačuje potřebu vývoje nových terapeutických přípravků, a tím zajištění adekvátní léčby pro pacienty. Důležitým prvkem v této oblasti výzkumu je detailní objasnění působení hormonu insulinu v organismu, zejména v kontextu s růstovými faktory podobnými insulinu (IGF-1 a IGF-2), které vykazují významnou vzájemnou strukturní homologii. Vysokou podobnost vykazují i jejich příslušné receptory, receptor insulinu (IR) a receptor pro IGF-1 a IGF-2 (IGF-1R), a díky tomu se mohou IGF-1 a IGF-2 do jisté míry vázat na IR a insulin na IGF-1R. Důležitá je zejména schopnost silné vazby IGF-2 na isoformu A IR. Na rozdíl od insulinu, který převážně zprostředkovává vstup glukosy do buněk, hormony IGF vyvolávají růstové (mitogenní) účinky. Zjištění, které strukturní determinanty v molekulách insulinu a IGF jsou zodpovědné za rozdílnou aktivaci receptorů, by mohlo poskytnout vysvětlení rozdílných odpovědí vyvolaných působením těchto hormonů na receptory cílových buněk a napomoci při vývoji funkčně selektivních analogů těchto hormonů. Cílem této bakalářské práce byla příprava a charakterizace analogů lidského insulinu prodloužených na C konci řetězce B o sekvence aminokyselin odvozených z domény C molekuly IGF-2. Příprava těchto hybridních analogů...
|
|
|
Příprava derivátů protinádorového léčiva ellipticinu a jejich oxidace cytochromy P450
Škodová, Petra ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Smrček, Stanislav (oponent)
Ellipticin je rostlinný alkaloid, který vykazuje významnou protinádorovou aktivitu, díky níž byl od 60. let 20. století středem zájmu. Od jeho objevení až po současnost byla publikována řada syntetický přístupů k získání tohoto protinádorového léčiva. Ellipticin je vlastně proléčivo, jehož farmakologické účinky jsou závislé na aktivaci dvěma skupinami enzymů, cytochromy P450 a peroxidasami. Výsledkem působení uvedených skupin enzymů jsou buď detoxikační, nebo aktivační metabolity ellipticinu. 13-Hydroxyellipticin a 12-hydroxyellipticin jsou produkty aktivačních reakcí, které se následně spontánně štěpí na karbeniové ionty, v této podobě se váží na deoxyguanosin za tvorby aduktů s DNA. 13-Hydroxyellipticin může mít potenciálně vyšší biologický účinek než ellipticin, a to právě díky tvorbě aduktů s DNA, pro kterou nevyžaduje enzymovou aktivaci. Záměrem diplomové práce byla proto snaha o syntézu tohoto derivátu. Meziproduktem při syntéze 13-hydroxyellipticinu je jiný derivát - 9-nitroellipticin. Výsledky diplomové práce ukazují, že oxidací 9-nitroellipticinu jaterním mikrosomálním systémem, jenž obsahuje cytochromy P450, vznikají minimálně 4 metabolity. 9-Nitroellipticin tak vykazuje podobné chování jako ellipticin. Redukcí nitroskupiny v poloze C-9 ellipticinu byl připraven 9-aminoellipticin. Tento...
|
|
|
Role lidské mitochondriální proteázy YME1L v biogenezi systému oxidační fosforylace
Tesařová, Jana ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Pecina, Petr (oponent)
Mitochondrie jsou součástí většiny eukaryotických buněk, kde mezi jejich hlavní funkce patří produkce ATP pomocí systému OxPhos. Systém OxPhos se skládá z jaderně a mitochondriálně kódovaných proteinových podjednotek. Kvalita těchto podjednotek (proteinů) musí být neustále kontrolována, protože u nich může docházet k defektním změnám. Za rozpoznání a odstranění poškozených mitochondriálních proteinů jsou zodpovědné specifické mitochondriální ATP-dependentní proteázy. Doposud byly identifikovány 4 takovéto komplexy aktivní v různých mitochondriálních subkompartmentech. Proteázy i-AAA a m-AAA se vyskytují ve vnitřní mitochondriální membráně. Zatímco proteáza i-AAA je aktivní v mezimembránovém prostoru, tak m-AAA proteáza funguje na straně mitochondriálního matrix. Cílem této práce bylo pomocí RNA interference a expresních studií charakterizovat buněčnou funkci lidské proteázy YME1L, která je orthologem kvasinkové i-AAA proteázy YME1, v buněčné linii HEK293. Z našich výsledků vyplývá, že YME1L je integrální membránový protein s molekulovou hmotností mezi 600-1100 kDa, jehož karboxylový konec vyčnívá do mezimembránového prostoru. Buněčná linie se stabilně "utišenou" expresí YME1L pomocí RNA interference vykazovala akumulaci podjednotek Ndufb6 a ND1 částečně složeného komplexu I a zvýšenou stabilitu...
|
|
|
Nové analogy lidského insulinu s kovalentně stabilizovanými cyklickými strukturami v C-konci B-řetězce
Kaplan, Vojtěch ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Flegel, Martin (oponent)
Diabetes mellitus patří mezi celosvětově hojně rozšířená metabolická onemocnění. Komplikovaná léčba a rok od roku narůstající počty lidí trpících diabetem ukazují na nezbytnost výzkumu v této oblasti, mezi jehož primární cíle patří zejména vývoj nových terapeuticky účinných léčiv a objasnění problematiky působení hormonu insulinu v těle. Insulin je peptidový hormon, mezi jehož hlavní funkce patří regulace hladiny krevní glukózy spojená s širokým dopadem na celý metabolismus. Účinek insulinu je zprostředkován insulinovým receptorem, na který se hormon váže ve své monomerní formě. Po vazbě insulinu na jeho receptor dochází v jeho molekule ke specifickým strukturním změnám, které vedou ke vzniku tzv. aktivní formy hormonu. Struktura této aktivní monomerické formy insulinu není v současné době známa. Studiem vazebné afinity řady insulinových analogů byla zjištěna důležitá úloha C-konce B-řetězce v molekule insulinu při jeho vazbě na receptor a následné aktivaci. Důležité strukturní informace, nezbytné pro vytvoření této práce, pak zejména přineslo studium struktury některých vysoce aktivních analogů insulinu s charakteristickým B26 -ohybem připravených v laboratoři Dr. J. Jiráčka ÚOCHB AV ČR. Cílem této práce byla příprava 3 nových insulinových analogů, které by hypotetickou aktivní konformaci hormonu...
|
|
|
Metabolismus karcinogenů a léčiv monooxygenasovým systémem
Moserová, Michaela ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Čeřovská, Noemi (oponent)
Ellipticin, alkaloid z rostlin čeledi Apocynaceae, vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Je pro-léčivem, jehož farmakologická účinnost a vedlejší genotoxické účinky závisí na metabolické aktivaci cytochromy P450 (CYP) a peroxidasami (Px). Z toho důvodu bylo cílem disertační práce poznání příspěvku jednotlivých CYP a Px k oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce a ledviny) laboratorního potkana, který byl vybrán jako vhodný model ilustrující osud ellipticinu v lidském organismu. Dále byly využity mikrosomální systémy myší s "deletovanou" reduktasou v játrech (HRNTM ) a myší kotrolní linie (WT) a purifikované enzymy CYP1A1 a 3A4. Sledován byl i vliv cytochromu b5 na produkci jednotlivých metabolitů (aktivačních a detoxikačních) ellipticinu a tvorba aduktů aktivovaného ellipticinu s DNA. Karcinogenní benzo[a]pyren (BaP) je po své aktivaci cytochromy P450 (CYPs) schopný kovalentní vazby na DNA. Sledovali jsme jeho schopnost tvorby aduktů s DNA a indukce enzymů CYP a NADPH:CYP reduktasy (RED) v myších játrech, hlavním orgánu tvorby aduktů BaP s DNA. CYP1A1 je označován za nejdůležitější enzym v metabolické aktivaci BaP. V práci jsme sledovali vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému) na metabolismus BaP. V disertační práce byly využity mikrosomální...
|
|
|
Biotransformace fenolických látek enzymovými systémy kvasinky Candida tropicalis a bakterie Comamonas testosteroni
Vilímková, Lenka ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Mareš, Jaroslav (oponent)
Kvasinka Candida tropicalis a bakterie Comamonas testosteroni se vyznačují schopností využívat fenol jako jediný zdroj uhlíku a energie. V naší laboratoři se zabýváme zejména studiem cytoplasmatických enzymů zodpovědných za první a druhý krok odbourání fenolu: NADPH-dependentní fenolhydroxylasy C. tropicalis i C. testosteroni a katechol 1,2- dioxygenasy C. tropicalis. Cílem naší práce je izolovat a částečně charakterizovat tyto enzymy. Fenolhydroxylasa C. tropicalis byla purifikována použitím následující kombinace metod: chromatografie a rechromatografie cytosolárních proteinů na DEAE Sepharose, frakční precipitace polyethylenglykolem 6000 a gelové permeační chromatografie na Sephacrylu S-300. Extracelulární fenolhydroxylasa C. testosteroni byla získána frakční precipitací kultivačního média polyethylenglykolem 6000 a gelovou permeační chromatografií na 4B Sepharose a Sephacrylu S-300. Katecholdioxygenasa byla z cytosolu C. tropicalis izolována za použití metod: chromatografie a rechromatografie cytosolárních proteinů na DEAE Sepharose, lyofilizace enzymového preparátu a gelové permeační chromatografie na Sephadexu G-100 Enzymová aktivita byla měřena buď pomocí HPLC nebo spektrofotometricky. Čistota enzymů byla sledována elektroforézou SDS-PAGE. Molekulová hmotnost enzymů byla určena pomocí...
|
|
|
Analyzing the complexity of auxin-related processes and their regulation
Simon, Sibu ; Zažímalová, Eva (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Souhrn Rostlinný hormon (fytohormon) auxin je důležitým regulátorem růstu a vývoje rostlin. Koncentrační maxima auxinu, nutná pro regulaci vývoje rostlin, se vytvářejí na základě spolupůsobení metabolických procesů, pasivní difuse molekul auxinu přes buněčnou membránu a aktivního transportu auxinu prostřednictvím přenašečů. V naší práci jsme použili skupinu sloučenin strukturně příbuzných hlavnímu endogennímu auxinu kyselině indol-3-octové a syntetickým auxinům kyselinám 2,4-dichlor- fenoxyoctové a naftalen-1-octové. Cílem bylo charakterizovat specifitu vůči auxinům u vývojově významných procesů, jako je aktivní transport auxinu přes buněčnou membránu a "genomický (transkripční)" a "negenomický (netranskripční)" přenos auxinem neseného signálu. Kromě vlastní charakterizace fyziologické aktivity daných látek jsme chtěli přispět k pochopení komplexní regulace fyziologických procesů závislých na auxinu a případně nalézt takové látky, jejichž chování se bude u jednotlivých procesů výrazně lišit. S využitím vybraných látek spolu s dalšími molekulárními nástroji jsme analyzovali negenomický mechanismus přenosu auxinového signálu, způsob účinku styrylových FM (Fei-Mao)-barviv na dynamiku membránově lokalizovaných auxinových transportérů, a účast ostatních fytohormonů - jmenovitě cytokininů - při regulaci hladin...
|
host ::
RSS.