|
Raman tweezers in microfluidic systems for automatic analysis and sorting of living cells
Pilát, Zdeněk
We have devised an automatic analytical and sorting system combining optical trapping with Raman spectroscopy in microfluidic environment, together with computerized real time image analysis, spectra processing and micromanipulation. This device serves to identify and sort biological objects, such as living cells of various prokaryotic and eukaryotic organisms based on their Raman spectral properties. This approach allowed us to collect information about the chemical composition of the objects, such as the presence and composition of lipids, proteins, or nucleic acids without using artificial chemical probes such as fluorescent markers. The non-destructive and non-contact nature of this optical analysis and manipulation allowed us to separate individual living cells of our interest in a sterile environment and provided the possibility to cultivate the selected cells for further experiments. The special microfluidic chip uses gravity to move the cells across the sorting area. Our system uses dedicated software to achieve fully automated spectral analysis and sorting. The devised system is a robust and universal platform for non-contact sorting of microobjects based on their chemical properties. It could find its use in many medical, biotechnological, and biological applications.
|
|
Úloha buněk přirozené imunity v patogenezi celiakie
Dáňová, Klára ; Palová Jelínková, Lenka (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Celiakie je autoimunitní onemocnění, ke kterému dochází u vnímavých jedinců po požití stravy obsahující lepek. Lepek (neboli gluten) a jeho monomerní frakce, gliadin, vyvolávají u pacientů s celiakií zánětlivé poškození střevní sliznice. Toto poškození je způsobeno buňkami imunitního systému, jež na setkání s peptidy lepku reagují silnou aktivací. Peptidy lepku mají schopnost aktivovat jak buňky adaptivního, tak buňky přirozeného imunitního systému. Tato práce je zaměřena na produkci interleukinu (IL)-1 u antigen prezentujících buněk stimulovaných štěpeným gliadinem. Monocyty a mononukleární buňky izolované z periferní krve (PBMC, z angl. peripheral blood mononuclear cell) pacientů s celiakií po stimulaci gliadinem sekretují významně více IL-1α a IL-1β než buňky zdravých dárců. Expresi IL-1β u PBMC izolovaných z krve pacientů s celiakií a stimulovaných gliadinem reguluje signální kaskáda, která zahrnuje kinázy rodiny MAPK a transkripční faktor NF-κB. Na myších dendritických buňkách připravených z prekurzorů z kostní dřeně (BMDC, z angl. bone marrow-derived dendritic cell) byla navíc určena role adaptorových proteinů MyD88 a TRIF a receptorů TLR2 a TLR4 (z angl. Toll-like receptor 2/4) v tomto procesu. Maturaci prekurzorové formy IL-1β u PBMC i myších BMDC stimulovaných gliadinem zajišťuje...
|
|
Mechanismy vývoje krevních cév v žaberní oblasti
Kolesová, Hana ; Grim, Miloš (vedoucí práce) ; Slípka, Jaroslav (oponent) ; Nečas, Emanuel (oponent)
Žabgní oblast a její cévy prochází v embryonálním vývoji rozsáhlou přestavbou, ktérá odráží také její fylogenetický vývoj. Studovali jsme mechanismy vývoje žaberní oblasti, abychom zjistili, jak se známý morfogen Sonic hedgehog (Shh) podílí na formování a přestavbě této oblasti a jejích cév. Význam Shh pro vývoj žaberní oblasti jsme posuzovali podle změn, které vyvolala jeho inhibice. Funkci Shh jsme u ptačích embryí krátkodobě inhibovali pomocí anti-Shh protilátky produkované do embrya in vivo hybridomovými buňkami 5E1; dále jsme Shh signální kaskádu inhibovali pomocí cyclopaminu. Výsledky ukazují, že Shh je nutný pro tvorbu de novo vznikajících cév v oblasti žaberních oblouků; dále také pro stabilitu cévní stěny, hlavně u vena cardinalis anterior. Shh ovlivňuje i další vývoj a přestavbu cév, jakou je například fůze aorta dorsalis, větvení arteria carotis interna a vývoj výtokového traktu srdečního. Shh nemá při krátkodobé inhibici vliv na proliferační aktivitu a apoptózu v mesenchymu žaberní oblasti. Domníváme se, že Shh ovlivňuje endotel krevních cév přímo, protože jeho receptor ptcl je exprimován v endotelových buňkách a při inhibici Shh exprese ptcl klesá. Zjistili jsme, že Shh neovlivňuje distribuci hladkých svalových buněk ve stěně cév a neovlivňuje ani expresi receptoru růstového faktoru krevních...
|
|
Studium komplexů kationických porfyrinů s nukleovými kyselinami pomocí spektroskopie povrchem zesíleného resonančního Ramanova rozptylu
Lásková, Barbora ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Michl, Martin (oponent)
Komplexy kationických porfyrinů s nukleovými kyselinami jsou zajímavé z hlediska transportu terapeutických oligonukleotidů do buněk nebo fotodynamické terapie nádorových onemocnění. Diplomová práce se zabývá studiem komplexů kationického metaloporfyrinu CuTMPyP4 s poly(dG-dC)2, kde je předpokládána interkalace porfyrinu mezi bázové páry polynukleotidu a s poly(dA-dT)2, poly(dA)·poly(dT), u kterých je usuzováno na vnější vazbu CuTMPyP4 k helixu. Měření byla prováděna pomocí SERRS, RRS a absorpční spektroskopie. Z časových vývojů SERRS spekter pro jednotlivé komplexy bylo zjištěno, že velikost intenzity SERRS spekter a rychlost SERRS kinetik z komplexů neodpovídá intuitivnímu předpokladu o nízkém SERRS signálu a jeho pomalém nárůstu v případě interkalace porfyrinu, neboť pro komplex CuTMPyP4 s poly(dG-dC)2 je průběh SERRS kinetiky velmi rychlý a výsledný SERRS signál mnohem větší, než pro poly(dA-dT)2, poly(dA)·poly(dT). Po porovnání výsledků ze SERRS a RRS se ukázalo, že při SERRS experimentech je pozorované spektrum důsledkem spíše než porfyrinu v komplexu důsledkem porfyrinu z komplexu uvolněného. Při charakterizaci koloidních systémů pro SERRS měření bylo dále zjištěno, že pro koloidy s nízkým -potenciálem je SERRS signál nestabilní s dobou expozice vzorku, což je patrně způsobeno projevem tvorby "hot...
|
|
Single particle analysis of size-segregated aerosol in Prague city center
Marvanová, S. ; Skoupý, Radim ; Kulich, P. ; Bendl, J. ; Hovorka, J. ; Machala, M.
Particulate matter (PM) is omnipresent pollutant in the ambient air known to cause cardiovascular and respiratory diseases (WHO 2004). Recently, outdoor air pollution and particulate matter in outdoor air pollution were classified as carcinogenic to humans, Group 1 (IARC 2015). Especially, ambient PM of aerodynamic diameter < 100 nm, ultrafine particles, appears to be of great importance due to its high specific surface area and high number concentration (Hughes et al. 1998). Ultrafine particles also easily enter and are being transferred in organisms, and interact with cells and subcellular components (Oberdorster et al. 2005). As the evidence of ultrafine PM significance increased, size-fractionated PMs sampled by various cascade impactors have been employed into the toxicological studies on cell cultures or isolated cells, using the organic extracts of size-fractionated PMs (Topinka et al. 2013, Topinka et al. 2015) or directly the size-fractionated particles (Becker et al. 2003, Ramgolam et al. 2009, Reibman et al. 2002, Loxham et al. 2013, Jalava et al. 2006, Thomson et al. 2015, Jalava et al. 2015). The aim of this study was to evaluate shape and composition of size-segregated aerosol particles, sampled by high volume cascade impactor, using electron microscopy and energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX).
|
|
Studium dielektrických vlastností struktur tenkých vrstev organických materiálů
Pospíšil, Jan ; Boušek, Jaroslav (oponent) ; Mikula, Milan (oponent) ; Zmeškal, Oldřich (vedoucí práce)
Dizertační práce je zaměřena na studium elektrických a zejména dielektrických vlastností tenkých vrstev organických materiálů, které mohou nacházet své uplatnění v organické elektronice a dalších odvětvích. Teoretická část se věnuje využití organických materiálů v organických fotovoltaických článcích, způsobům jejich depozice a metodám charakterizace. Jsou zde dále popsány teoretické poznatky o dielektrické spektroskopii včetně metod stanovení fyzikálních vlastností a vyhodnocení experimentálních dat. Experimentální část se věnuje studiu nízkomolekulárních organických solárních článků s objemovým heteropřechodem složeného z elektron donorní molekuly DPP(TBFu)2 a elektron akceptorních derivátů fullerenu PC60BM, PC70BM a TC60BM. Experimentální část je rozdělena na dvě hlavní části. První část se věnuje studiu dějů probíhajících na rozhraní aktivní vrstva/kontakt, druhá část se potom zaměřuje zejména na transportní procesy uvnitř struktury fotovoltaických článků a obsahuje i studium perovskitových solárních článků.
|
|
Optické měření elektromechanických projevů srdečních buněk
Čmiel, Vratislav ; Križanová,, Olga (oponent) ; Babula, Petr (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
Disertační práce se zabývá aplikací optických metod měření s využitím technik optické mikroskopie a fluorescenční mikroskopie při měření elektromechanických projevů izolovaných srdečních buněk a shluků diferencovaných kardiomyocytů. První navržená metoda využívá účelné kombinace fluorescenční mikroskopie s využitím rychlé fluorescenční kamery s vysokým rozlišením a mikroskopie atomárních sil pro současné měření vápníkových transientů a kontrakce shluků srdečních buněk. Získané signály prochází filtrací, zpracováním a analýzou. Výsledně získané funkční parametry kardiomyocytů získané analýzou signálů po aplikaci kofeinu jsou hodnoceny srovnáním s funkčními parametry získanými při kontrolním měření. Druhá navržená metoda je aplikována na shluky kardiomyocytů za účelem měření jejich kontrakce. Signály získané optickou metodou jsou analyzovány a výsledky porovnány s referenčním signálem získaným měřením s pomocí mikroskopie atomárních sil. Pro spolehlivější a stabilnější měření kontrakce v experimentech zaměřených na současné měření s vápníkovými transienty u izolovaných kardiomyocytů byly navrženy a realizovány optické metody měření kontrakce založené na detekci konců s využitím úpravy mikroskopického obrazu přeostřením a s využitím fluorescenční metody měření.
|
| |
| |
|
Estrogen receptor beta (ERβ) in testicular cells and sperm
Dostálová, Pavla ; Žatecká, Eva ; Děd, Lukáš ; Dorosh, Andriy ; Postlerová, Pavla ; Jonáková, Věra ; Dvořáková-Hortová, Kateřina ; Pěknicová, Jana
Estrogen is a steroid hormone that plays an important role during sperm development in the male and female reproductive tract. Estrogen signalling is a complex process that depends on cell milieu and presence of receptors. Thanks to the steroid nature of estrogens, they can pass through the plasmatic membrane and bind to the intracellular estrogen receptors (ERs). Within the cell, there are several pools of ERs. One of them is localized to the cell nucleus and their activation leads to direct or indirect binding to DNA and ultimately to alternation in gene expression (genomic pathway). Other pools of ERs are associated with plasma membrane or are located in cytosol. Activation of membrane associated ERs leads to rapid non-genomic responses. Nowadays, two classical estrogen receptors are known – ERα and ERβ. Since ERβ is a predominant variant in testes, we focused our study on expression of ERβ variants in murine testes and sperm. We detected two variants of ERβ at mRNA level in both, testes and sperm. These variants differ in 54 nucleotids within the ligand binding domain and this variability results in different affinity to estrogen. We analyzed individual testicular cell types (spermatogonia, spermatocytes, spermatids, Sertoli cells) by RT-qPCR. Our results suggest that both ERβ variants are coexpressed in the same cell type and may therefore interact together. This may have consequences in mediating of estrogen signalling. Moreover, ERβ is expressed more in the later stages of spermatogenesis suggesting the role of ERβ in these stages or alternatively in spermatozoa alone. At the protein level, we detected ERβ in nuclear, membrane and cytosolic fraction prepared from testicular tissue suggesting the involvement of both, genomic and non-genomic, pathways of estrogen signaling in testes. In sperm, anti-ERβ antibodies localized ERβ in acrosome region and tail which is in accordance with the known role of estrogen on capacitation, acrosome reaction and motility.
|
host ::
