|
|
Bioorthogonal reactions on DNA for regulation of transcription
Chakrapani, Aswathi ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Zimčík, Petr (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
Souhrn Tato disertační práce popisuje návrh a syntézu derivátů nukleotidů a DNA nesoucích fotolabilní nebo glukosylované modifikace připojené k epigenetické značce 5-(hydroxymethyl)pyrimidinu, pomocí chemických a enzymatických metod a dále studium regulace genové exprese na bakteriální (Escherichia coli RNA polymeráza) in vitro transkripční úrovni. V první části práce je popsán design a syntéza 5-nitrobenzyloxymethyl-2'-deoxyuridinových (dUNB) a -cytidinových (dCNB) fosforamiditů. Tyto nukleosidové fosforamiditové stavební bloky chráněné fotolabilní skupinou byly použity při automatizované syntéze oligonukleotidů (ONs) na pevné fázi modifikovaných ve specifických polohách. ONs byly následně použity jako přímé primery v polymerázové řetězové reakci (PCR) pro konstrukci dUNB- a dCNB-modifikovaných DNA templátů v konkrétních pozicích promotorové oblasti. Značená DNA byla poté v této oblasti ozářena světlem, které způsobilo uvolnění NB-skupin a vedlo ke vzniku odpovídajících specifických míst nesoucích volnou 5-(hydroxymethyl)ovou (5hm) modifikaci. Následně byly provedeny bakteriální in vitro transkripční studie modifikované i přirozené DNA. Inkorporace epigenetických pyrimidinových nukleotidů dUNB a dCNB nesoucích fotosenzitivní chránící skupiny do promotorové oblasti (-35) templátové DNA vedla k částečné...
|
|
|
Regulace mykobakteriální transkripce
Kafka, Vojtěch ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Dostálová, Hana (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) je enzym katalyzující syntézu RNA řetězce a uplatňuje se jako hlavní enzym transkripce. RNAP u mykobakterií je odlišná od ostatních bakteriálních RNA polymeráz. Pro svoji funkci vyžaduje speciální transkripční faktory, jako jsou RbpA nebo CarD. Zároveň se na mykobakteriální RNA polymerázu váže malá RNA (sRNA) Ms1, která reguluje množství polymerázy v buňce. V naší laboratoři byl také objeven protein MoaB2 jako nový vazebný partner interagující s mykobakteriální A (gen sigA), podjednotkou RNAP, významnou pro rozpoznání počáteční sekvence promotoru a iniciaci transkripce. Funkce MoaB2 v regulaci transkripce a genové exprese je doposud neznámá. Prvním cílem této diplomové práce je přispět k objasnění mechanismu, jakým Ms1 reguluje množství RNAP. Výsledky ukázaly, že tato regulace je na úrovni transkripce a to na úrovni ovlivnění aktivity promotorů řídících expresi rpoB-rpoC, které kódují katalytické podjenotky RNAP. Druhým cílem této práce je charakterizovat interakce MoaB2 s proteiny transkripčního aparátu. Výsledky potvrdily interakci MoaB2 se A a k této interakci není potřebná ani RNAP ani transkripční faktory RbpA a CarD. Role N-terminální domény A pro interakci s MoaB2 nebyla prozatím potvrzena. Shrnuto, tato práce významně přispívá k našemu pochopení mykobakteriálního...
|
|
|
The omega subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase.
Mikesková, Klára ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent)
Transkripce je zprostředkována enzymem RNA polymerázou (RNAP). RNAP obsahuje jádro tvořené dvěma podjednotkami α, a po jedné β, β' a ω. Tyto podjednotky jsou konzervované u všech bakterií. Podjednotka ω je malá podjednotka o velikosti 7,6 kDa, která se váže na podjednotku β'. Podjednotka ω je důležitá pro složení a integritu RNAP a výběr promotorů. Toto bylo ukázáno experimenty provedenými na Gram-negativních bakteriích, ale vědomosti o podjednotce ω u Gram-pozitivních bakterií jsou minimální. Ve své diplomové práci jsem charakterizovala ω z modelové Gram-pozitivní bakterie ze skupiny Firmicutes, Bacillus subtilis. Nejprve jsem připravila několik expresních kmenů pro izolaci podjednotky ω z Bacillus subtilis. Následně jsem úspěšně provedla její izolaci, což byl hlavní a původní cíl této Diplomové práce. Dále jsem testovala vliv podjednotky ω na transkripci in vitro pomocí asociace RNAP s primárním faktorem A i s alternativními faktory σF a σE , které regulují sporulaci u Bacillus subtilis. Také jsem studovala vliv podjednotky δ, malé podjednotky RNAP nacházející se u skupiny Firmicutes, a to samostatně, i v kombinaci s podjednotkou ω. Mé výsledky odhalily, že podjednotka ω stimuluje transkripci z promotorů vegetativních i těch asociovaných se sporulací. Navíc, tato stimulace byla synergicky...
|
|
|
Role AGO-hook domény histonového chaperonu SPT6L v regulaci genové exprese
Kašpar, Tomáš ; Čermák, Vojtěch (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent)
AGO-hook domény přítomné u některých eukaryotických proteinů slouží k vazbě proteinů z rodiny ARGONAUTE (AGO). Proteiny AGO fungují v mnoha procesech regulujících expresi genů za pomoci jimi navázané malé RNA (sRNA). sRNA slouží k rozpoznání cílového komplementárního transkriptu. Tato práce si klade za cíl zjistit roli předpokládané AGO-hook domény proteinu SPT6L. SPT6L je transkripční elongační faktor z komplexu RNA polymerázy II (Pol II), kde slouží jako histonový chaperon a účastní se epigenetického značení histonů. SPT6L je u Arabidopsis thaliana jedním ze dvou paralogů proteinu SPT6, který je charakterizován právě přítomností AGO-hook domény, což je ryze rostlinné specifikum. Funkce této domény není u rostliny A. thaliana známá. Přesto by se dalo předpokládat, že tato doména bude zajišťovat navádění proteinů AGO do komplexu Pol II, čímž poté může umožnit regulaci modifikací chromatinu, či kotranskripčně ovlivňovat transkripty Pol II cílené sRNA. Tato práce nastiňuje funkci AGO-hook domény proteinu SPT6L u rostliny A. thaliana. Získané výsledky ukazují interakci AGO-hook domény proteinu SPT6L s AGO a její vliv na expresi a na zpracování transkriptů. Klíčová slova SPT6L, AGO-hook, transkripce, chromatin, Arabidopsis thaliana
|
|
| |
|
|
Faktory důležité pro formování Cajalova tělíska
Roithová, Adriana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Valentová, Anna (oponent)
Tato re er e popisuje strukturu a funkci jaderných domén nazývajících se Cajalova t líska (CB). CB obsahují proteiny a faktory, které se ú astní uspo ádání a modifikace snRNP. Tyto t líska se nachází u obratlovc i bezobratlých a nejdeme je i v rostlinách. Ne v echny typy bun k v ak obsahují CB. Jejich po et a velikost se odvíjí od transkrip ní aktivity bu ky a fázi bun ného cyklu. Tato práce pojednává o faktorech, které mají vliv na formaci CB. Jeden z nejd le it j ích faktor je hladina snRNP a transkrip ní aktivita. V poslední dob se v ak ukazuje, e významnou roli ve formaci CB má i fosforylace coilinu a jiných komponent. Jiné studie ukazují na vliv okolního prost edí. Také se zde diskutuje regulace biogeneze CB, která není je t zcela objasn na. Klí ová slova: Cajalovo t lísko, coilin, bun né jádro, snRNP, pre-mRNA sest ih, transkripce
|
|
|
Delta podjednotka RNA polymerázy u Grampozitivních bakterií
Matějčková, Jitka ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
1 Abstrakt Aby bakteriální buňka přežila neustále se měnící podmínky, musí se na ně adaptovat. Tato adaptace je podmíněna změnou genové exprese. Klíčovým krokem genové exprese je transkripce. Hlavním enzymem bakteriální transkripce je RNA polymerasa (RNAP), což je esenciální vícepodjednotkový enzym. RNAP je nejvíce prostudována u Escherichia coli, modelového organismu gram negativních bakterií. Porovnala jsem E. coli a Bacillus subtilis (zástupce gram pozitivních bakterií) a shrnula jsem rozdíly v RNAP a transkripci. Jejich RNA polymerasy se liší přítomností podjednotky δ u gram pozitivních bakterií. Tato podjednotka zvyšuje promotorovou selektivitu, recykluje jádro RNAP a celkově stimuluje syntézu RNA. Podjednotka δ ovlivňuje sporulaci a virulenci některých bakterií. V této práci jsem shromáždila současné poznatky o jednotlivých částech genové exprese, zejména o regulaci iniciace transkripce a o podjednotce δ RNAP.
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
|
Porovnání efektivity výuky za pomoci počítače vs. 3D modelů
Andělová, Denisa ; Janštová, Vanda (vedoucí práce) ; Jáč, Martin (oponent)
V současné době zájem žáků o přírodní vědy neustále klesá, ačkoli je tato oblast vzdělání v praktickém životě velmi důležitá (medicína, životní prostředí, atd.) a na trhu práce velmi žádaná. Molekulární biologie, učivo o DNA a přenosu genetické informace je pro žáky abstraktní a těžko představitelné téma, které je i pro učitele náročné na vysvětlení. Existuje mnoho možností, jak tuto učební látku vyučovat. Velmi populární jsou badatelsky orientovaná výuka nebo praktická výuka v laboratořích. Každá škola však nemá k dispozici vlastní laboratoř, aby žáci mohli laborovat, badatelsky orientovaná výuka je časově náročnější na přípravu a ne každé téma je vhodné takto učit. Další možností je využít k vizualizaci "neviditelných" molekul a procesů počítačový software a animace nebo 3D fyzického modelu či si vlastní model dané molekuly vyrobit. Ve své diplomové práci jsem zkoumala vliv použití počítačů a animací ve výuce v porovnání s použitím 3D fyzického modelu DNA a výroby vlastního modelu DNA na znalosti žáků. Dalšími faktory, které mně zajímaly, byly pohlaví a zaměření žáků a jejich případný vliv na znalosti. Výzkum jsme prováděla v pěti třídách na třech pražských gymnáziích a zúčastnili se ho žáci třetího ročníku šestiletého studia, přírodovědný seminář sedmého ročníku osmi- letého studia a žáci...
|
|
|
Lékové interakce derivátů resveratrolu s nukleárním receptorem PXR
Marešová, Veronika ; Pávek, Petr (vedoucí práce) ; Trejtnar, František (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Veronika Bečicová Školitel: Prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. Název diplomové práce: Lékové interakce derivátů resveratrolu s nukleárním receptorem PXR Deriváty resveratrolu jsou přírodní látky stilbenoidní struktury s antioxidační aktivitou, obsažené především v červeném víně a grepu. V minulosti se studovaly interakce resveratrolu s pregnanovým X receptorem (PXR), který reguluje nejdůležitější biotransformační enzymy v játrech a střevě včetně cytochromu P450 3A4 (CYP3A4). Tyto publikované výsledky si však často protiřečí. V mé diplomové práci jsem se zaměřila na studium interakcí resveratrolu a jeho derivátů s PXR receptorem pomocí modifikované metody gene reporter assay spojené s kvantitativní reverzní polymerázovou řetězovou reakcí (qRT-PCR). Tato metoda byla zavedena, jelikož resveratrol i jeho deriváty inhibovaly luciferázu, nemohly být proto testovány klasickou metodou gene reporter assay. Účinky resveratrolu na expresi CYP3A4 jsem rovněž studovala qRT-PCR na diferencované jaterní linii HepaRG. Podařilo se zavést metodu gene reporter assay s detekcí luciferázy pomocí qRT-PCR na hepatomové linii HepG2 transfekované CYP3A4 reportérovým luciferázovým konstruktem. U všech testovaných...
|
host ::
RSS.