|
|
Study of the variations in the expression of different adhesion and cytoskeletal proteins of podocytes (E-Cadherin, Podocin, Vimentin) due to Bisphenol A
Chvojanová, Zuzana ; Kovařík, Miroslav (vedoucí práce) ; Němečková, Ivana (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biologických a lékařských věd The University of Alcalá, Faculty of Medicine, Department of biomedicine and biotechnology Student: Zuzana Chvojanová Školitel: PharmDr. Miroslav Kovařík, Ph.D. Konzultant: María Isabel Arenas Jimenéz Název diplomové práce: Studie změn v expresi různých adhezivních a cytoskeletálních proteinů podocytů (E-kadherin, Podocin, Vimentin) v důsledku Bisfenolu A Bisfenol A (BPA) patří mezi nejrozšířenějsí sloučeniny na světě, jehož produkce činí ročně vice než 6 miliard tun. Je široce používaný jako součást polykarbonátových plastů a epoxidových pryskyřic, z nichž jsou vyráběny znovu použitelné plastové lahve, potravinové boxy a některé lékařské vybavení. Také se používá k potažení vnitřní vrstvy plechovek. V dříve provedených studiích bylo zjištěno, že BPA v lidském organismu přispívá ke vzniku mnoha chronických onemocnění jako například onemocnění ledvin - diabetická nefropatie. Podocyty - terminálně diferenciované buňky Bowmanova pouzdra glomerulu - jsou nedílnou součástí filtrační bariéry, kde hrají důležitou roli v zabránění průniku plasmatických proteinů do moči. Proto jsme se v této studii zaměřili na efekt BPA právě na tyto buňky a jejich konkrétní proteiny, a to pomocí in vivo a in vitro metod....
|
|
|
Příprava Oryzasinu 1 pro štěpení proteinů v experimentech vodík/deuteriové výměny.
Šintáková, Kristýna ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Jurnečka, David (oponent)
Vodík/deuteriová výměna v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (HXMS) je stále populárnější technikou strukturní biologie. Její prostorové rozlišení závisí na účinnosti fragmentace nebo proteolytickém štěpení studovaného proteinu. Z toho důvodu je snaha hledat nové proteasy, které by nejen byly schopné štěpit zkoumaný protein při podmínkách HXMS, ale také poskytovaly co největší pokrytí sekvence proteinu. Tato práce se zabývá nalezením optimálních podmínek produkce aspartátové proteasy Oryzasinu 1 pro potenciální použití v experimentech HXMS. Z dostupných plazmidů byly vybrány vhodné produkční klony, pomocí peptidového mapování byla ověřena identita produkovaného proteinu a následně byly nalezeny vhodné produkční podmínky. Na základě těchto výsledků bylo přistoupeno k produkci proteinu ve velkém objemu a k izolaci inkluzních tělísek. Klíčová slova: Oryzasin 1, proteasy, vodík/deuteriová výměna v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (HXMS)
|
|
|
Inducibilní expresní systémy a jejich využití ve studiu parazitických organismů.
Horáčková, Vendula ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
1 Abstrakt Inducibilní expresní systémy jsou systémy, které umožňují ‚zapínat' a ‚vypínat' expresi genu zájmu, a jsou tedy užitečným nástrojem pro studium funkce genů. Existují desítky různých inducibilních expresních systémů, které se navzájem liší úrovní, na které k indukci dochází, dobou indukce, možnostmi využití atd. V této práci budou popsány tři typy inducibilních expresních systémů, na kterých budou demonstrovány obecné rysy systémů regulovaných na úrovni transkripce. Jsou to systémy založené na regulaci lac operonu Escherichia coli, dále systémy využívající regulačních elementů transpozonu Tn10 E. coli, které jsou zodpovědné za rezistenci vůči tetracyklinu, a nakonec systémy regulované agonisty receptoru pro steroidní hormon ekdyson, který je klíčovým regulátorem vývoje hmyzu. Práce obsahuje i kapitolu o využití inducibilních expresních systémů u parazitických organismů.
|
|
|
Diferenciální exprese transkriptů slinných žláz klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
KROPÁČKOVÁ, Sára
Klíšťata využívají různé mechanismy k potlačení hostitelské imunity. V této práci jsem porovnala expresi deseti transkriptů z klíštěcích slinných žláz, které jsou exprimované více při sání na hostiteli s aktivními imunitními reakcemi, v porovnání se sáním na systému umělého sání. Dále jsem zkoumala antikomplementový protein 1, AC1. Připravila jsem sérum se specifickými protilátkami a zkoumala expresi tohoto proteinu při sání na různých hostitelích a v nymfách. Také jsem testovala kovalentní interakce rekombinantu AC1 s proteiny z krevní plazmy hostitele. Tato studie napomáhá pochopení regulace exprese během sání klíštěte a přibližuje některé klíštěci slinné proteiny.
|
|
|
Involvment of PDA3 in oxidative stress response
Ženklová, Lucie ; Vokřál, Ivan (vedoucí práce) ; Jirkovský, Eduard (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Lucie Ženklová Školitelé: Prof. Fabio Altieri Ph.D. a PharmDr. Ivan Vokřál, Ph.D. Název diplomové práce: Involvement of PDIA3 in oxidative stress response PDIA3 je členem rodiny protein disulfid isomeráz (PDI) a jedná se o protein, uplatňující se při odpovědi organismu na stres. Dále je zapojen do různých buněčných signálních drah a má v buňce nejrůznější funkce. Jeho nejznámější role je v endoplazmatickém retikulu, kde plní funkci hlavně při skládání a kontrole kvality glykoproteinů. Nicméně jeho existence byla popsána také v mnoha jiných buněčných kompartmentech, například v jádře, mitochondriích, na buněčném povrchu nebo v cytosolu, kde zasahuje do nejrůznějších procesů (fúze spermie s vajíčkem, negenomická odpověď na vitamín D3, příjem vápníku buňkou,transkripční faktor v jádře atd.). Zatímco v některých případech musí být mechanismus jeho působení potvrzen dalšími studiemi, četná pozorování potvrzují jeho účast v přenosu různých signálů z buněčného povrchu (např. kooperce se STAT proteiny) a v regulačních procesech v jádře. V nedávných studiích byla také potvrzena jeho zvýšená exprese při různých patologických procesech. Cílem naší práce bylo zjistit, jaká je úloha PDIA3 proteinu při...
|
|
|
The analysis of structural details of the NMDA receptor
Radilová, Kateřina ; Balík, Aleš (vedoucí práce) ; Jakubík, Jan (oponent)
NMDA receptor je nezbytnou součástí exitační transmise v centrální nervové soustavě. Pozměněná funkce NMDA receptorů je spojována s mnoha neurodegenerativními a neuropsychiatrickými chorobami. Vyřešené krystalové struktury NMDA receptorů znamenaly velký posun v pochopení detailů jejich funkce. Bohužel tyto v současnosti dostupné struktury představují jen některé funkční stavy receptoru a také několik strukturních informací stále chybí. Ke kompletnímu porozumění procesu aktivace a deaktivace NMDA receptorů je potřeba doplnit stávající informace dalšími studiemi. Cílem této práce bylo pomocí kombinace různých metod (počítačové modelování, klonování, biochemické metody, exprese a purifikace proteinu a strukturní hmotnostní spektrometrii) získat nová strukturní data, kterými bychom byli schopni doplnit mezery v současnosti dostupných modelech a strukturách receptoru, zejména pak receptoru v různých funkčních stavech. Klíčová slova NMDA receptor, glutamátový receptor, počítačové modelování, struktura, klonování, exprese proteinu
|
|
|
Příprava glutamátkarboxypeptidasy III v savčím expresním systému
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Role glutamátkarboxypeptidasy II v savčím organismu je již poměrně dobře prozkoumaná, avšak o jejím homologu - glutamátkarboxypeptidase III - je známo jen minimum informací. Pro strukturní a funkční charakterisaci proteinu je zapotřebí velké množství proteinu, který je možno získat expresí v tkáňových kulturách. Vlastnosti proteinu mohou být ovlivněny posttranslačními mo- difikacemi, přičemž různé organismy provádějí různé posttranslační modifikace. Proto jsme se rozhodli vyvinout systém pro produkci rekombinantního GCPIII v savčích buňkách. Nejprve byl zaveden savčí expresní systém HEK 293-6E jako náhrada dosavadního hmyzího ex- presního systému. Výhodou tohoto savčího expresního systému je jeho snadná kultivace v suspenzních podmínkách a možnost transientní transfekce. Dále byly optimalizovány transfekční podmínky pro tento systém pomocí exprese zeleného fluorescenčního proteinu, pro snadnou detekci pomocí průtokové cyto- metrie. DNA kódující extracelulární část myší GCPIII (mEXSTII) byla klonována do pěti různých expres- ních plasmidů s použitím různých značek pro afinitní chromatografii (polyhistidinová kotva nebo tzv. Fc značka) na N- nebo C-konci připravovaného proteinu. Připravenými plasmidy byly transfekovány buňky. Pomocí imunochemické detekcce byla v médiích testována přítomnost...
|
|
|
Studium molekulární organizace systému cytochromu P450 pomocí fotoaktivovatelných proteinů
Dědič, Jan ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Systém cytochromu P450 je velmi významný z hlediska metabolismu endogenních látek a xenobiotik. Tento systém se skládá z cytochromu P450, NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy (CPR), cytochromu b5 a NADH:cytochrom b5 reduktasy (CYB5R3). Objasnění protein-proteinových interakcí mezi jeho částmi je nezbytné pro pochopení fungování celého systému. Metoda kovalentního síťování se jeví jako velmi vhodná pro studium těchto interakcí. V této práci byl použit fotoaktivovatelný analog aminokyseliny L-methioninu (L-foto-methionin) jako síťovací činidlo. Tato práce se zabývá organickou syntézou L-foto-methionu, expresí a izolací CPR a CYB5R3 jako fotoaktivovatelných proteinů s inkorporovaným L-foto-methioninem. Pro expresi byl použit auxotrofní kmen E.coli B834 (DE3) a M9 miminální medium. Úspěšně byla exprimována a izolována CYB5R3 s inkorporovaným L-foto-methioninem. Míra inkorporace byla ověřena hmotnostní spektrometrií. Dále byla testována schopnost síťování CYB5R3 s cytochromem b5. Klíčová slova: fotolabilní aminokyseliny, exprese proteinů, syntéza
|
|
|
Příprava a charakterizace syntetické mRNA kódující pankreatické transkripční faktory
Loukotová, Šárka ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Jirák, Daniel (oponent)
Diabetes mellitus 1. typu je závažné autoimunitní onemocnění, při kterém v pankreatu dochází k zániku β-buněk produkujících insulin. Pacienti postižené tímto onemocněním jsou odkázáni na celoživotní zevní podávání insulinu. V současné době je jedinou dostupnou léčebnou metodou buď transplantace celého orgánu pankreatu, nebo izolovaných Langerhansových ostrůvků. Kvůli nedostatku vhodné tkáně k transplantaci a náročné léčbě diabetu probíhá intenzivní výzkum nových alternativních zdrojů buněk produkujících insulin. Jednou z metod přípravy buněk produkujících insulin je tzv. transdiferenciace pankreatických exokrinních buněk pomocí specifických transkripčních faktorů. V této práci byla k transdiferenciaci exokrinní buněčné linie AR42J použita in vitro synteticky připravená mRNA kódující transkripční faktory Pdx1, Ngn3 a MafA. Primární sekvence mRNA byla optimalizována pro přípravu velmi stabilní mRNA s vysokou mírou translace. Hlavními stabilizačními prvky mRNA byly 3' a 5' nepřekládaná oblast genu pro β-globinu, jehož mRNA vykazuje životnost až 24 hod. Na základě transfekce do buněk AR42J a následné imunofluorescenční detekce byla ověřena správná funkce synteticky připravené mRNA. Synteticky připravené mRNA pro transkripční faktory Pdx1, Ngn3 a MafA byly následně použity k transdiferenciaci...
|
|
| |
host ::
RSS.