|
|
Mutant p53 protein and its binding and transactivation properties
Vojsovič, Matúš ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The "genome guardian" protein p53 plays an important role in cancer growth. P53 mutations occur in more than 50 % of human cancers. Mutated proteins significantly affect the proper functioning of cells. Due to the mutation, proteins can gain, but also lose, some of their functions, which also help them in modulating cell metabolism. Mutant forms of p53 may be involved in indirect binding or direct binding to DNA. They appeared to have a lower binding activity to the DNA than non-mutated p53. The experimental part of the thesis focuses on measuring the binding properties of selected p53 mutants using gel retardation analysis and using an atomic force microscope and monitoring the transactivation potential. The results were compared with the wild-type form of p53. It has been found that binding to the most common types of local DNA structures reduces the binding activity of p53 mutants over the wild-type. P53 mutants has been shown to have a lower intensity of transactivation than the wild-type p53 by studying their transactivation abilities and also they are able to reduce the intensity of transactivation when co-expressed with p53.
|
|
|
Influence of cultivation conditions on the production of recombinant proteins
Gardošová, Zuzana ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.
|
|
|
Analysis of C. necator genome changes after evolutionary adaptation
Vojsovič, Matúš ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The p53 protein is a transcription factor that belongs to the group of the tumour suppressor proteins. p53 functions include cell cycle regulation, interaction with DNA, and responses to damaged DNA that may lead to apoptosis or even senescence may occur. The theoretical part summarizes the latest information about the chemical structure and functions of the protein p53 and allosteric modifications that the p53 protein may possess in cells. It also describes selected methods of isolation and characterizes proteins. The aim of the experimental part was to isolate and characterize -isoforms of the p53 protein, which were isolated from the microorganism E.coli. Protein production was preceded by preparation and transformation of plasmids into production cells. From the production cells, 4 -isoforms of p53 were isolated by affinity chromatography, due to the polyhistidine anchor that the proteins contain. The isolated proteins were subsequently characterized by SDS-PAGE and western blotting. Moreover, the transactivation potential in the yeast system was monitored by luciferase assay under conditions involving the use of various culture media, as well as expressed or coexpressed under the inducible GAL1 promoter and the constitutive GPD promoter.
|
|
|
Využití kvasinkového isogenního systému pro studium interakcí proteinu IFI16 s DNA
Kratochvilová, Libuše ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovaného proteinu 16 (IFI16) k sekundárním lokálním strukturám G-kvadruplexu (G4) a jeho mutacím v jednohybridním kvasinkovém systému (Y1H). Protein IFI16 v buňce rozpoznává vlastní a cizorodou nebo poškozenou DNA, podílí se na tvorbě inflamazomu a indukuje expresi interferonu typu I (IFN-I). Rovněž má podíl na regulaci transkripce a restrikci virové infekce. Bylo prokázáno, že protein IFI16 se preferenčně váže ke strukturám G-kvadruplexů a je schopen je touto vazbou stabilizovat. G-kvadruplexy jsou řazeny mezi nekanonické struktury DNA a RNA tvořené sekvencemi bohaté na G. Snadno jsou tvořeny za fyziologických podmínek a nachází se v řadě významných regulačních strukturách genomu jako jsou telomery nebo promotory onkogenů. Jsou také součástí řady virových genomů. To z nich dělá vynikající potenciální cíle při léčbě nádorových a virových onemocnění. V první experimentální části práce byly připraveny nové reportérové kmeny kvasinek S. cerevisiae metodou Delitto Perfetto, které se lišily pouze v sekvenci s potenciálem tvorby G-kvadruplexu, které byly navrženy a analyzovány programem DNA Analyser. Správnost vkládaných sekvencí byla ověřena PCR a Sangerovým sekvenováním a srovnáním s dodanými sekvencemi oligonukleotidů programem Blast. V druhé části práce byly nově připravené kmeny transformovány vektory pro expresi proteinů p53, IFI16 a posuzován vliv vazby IFI16-G4 na expresi reportérového genu ve spojitosti s nádorovým supresorem p53 s využitím luciferázových reportérových testů. Vyhodnocení proběhlo na základě statistické analýzy velikostí účinků získaných po normalizování signálu luminescence na optickou hustotu kultury při vlnové délce 600 nm. Ze získaných výsledků vyplývá, že protein IFI16 má různý vliv na trans-aktivační potenciál nádorového supresoru p53 v závislosti na vazbě k vznikajícím strukturám v blízkosti promotoru genu, a že k úspěšnému vytvoření G-kvadruplexu bylo třeba dosáhnout prahové hodnoty G4Hunteru skóre alespoň 1,591 a zohlednit potenciál dané sekvence formovat úspěšně alespoň 2 G-tetrády.
|
|
|
Testování viability nádorových linií buněk po působení chemických látek a chemoterapeutik
Horáčková, Lucie ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V teoretické části jsou rozebrány jednotlivé typy testů viability založené na kolorimetrických změnách roztoku. Dále jsou charakterizovány proteiny HSP, které nejsou spojovány pouze s teplotním šokem, ale projevují se také během jiných stresů, například při vystavení buňky UV záření, chladu, extrémnímu pH či těžkým kovům. Pro buňku jsou důležité, protože pomáhají vytvořit správnou konformaci proteinů, které byly poškozeny buněčným stresem. Interagují také s novými nesbalenými proteiny a zajišťují jejich správné skládání. Proteiny, které jsou molekulárními chaperony ovlivňovány se souhrnně nazývají klientské proteiny. Některé HSP se také podílejí na transportu přes membránu či degradaci. S těmito proteiny kooperují tzv. kochaperony, ty jsou u proteinů teplotního šoku důležité, protože jim pomáhají při sbalování proteinů, a to zejména tím, že katalyzují hydrolýzu ATP na ADP. Také je zde popsána cisplatina a její deriváty, včetně mechanismu působení a nežádoucích účinků. Práce byla zaměřena na zjištění cytotoxicity cisplatiny a jejích derivátů. Po navození stresových podmínek v buňce působením cytostatik byly zjištěny změny v množství proteinů teplotního šoku a kochaperonů. Pomocí konfokální mikroskopie byla zjištěna lokalizace proteinů teplotního šoku a proteinu p53 v buňce.
|
|
|
Analýza trankripčních variant genu TP 53 v lidských leukemických buňkách
Vlahová, Veronika ; Mgr.Diana Grochová, Ph.D. (oponent) ; Malčíková,, Jitka (vedoucí práce)
Teoretická část diplomové práce shrnuje obecné informace o lidském genu TP53 a proteinu p53, který je tímto genem kódován. Je zde pojednáno také o transkripčních variantách – izoformách p53. Experimentální část je zaměřena na detekci izoformy p53 a její kratší, dosud nepopsanou formu. Výchozím materiálem je periferní krev pacientů Fakultní nemocnice Brno, ze které byla po zpracování izolována RNA. Ta byla dále přepsána reverzní transkripcí do cDNA, která byla amplifikována pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Experimentálním měřením bylo dokázano, že p53 se vyskytuje ve všech B-lymfocytech pacientů s chronickou lymfocytární leukémií. Byla také prokázána existence kratší formy p53.
|
|
|
Nekanonické funkce IL-1α
Novák, Josef ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Brdička, Tomáš (oponent)
1α (IL 1α) je cytokin s lépe prozkoumaná role IL 1α spouštění prozánětlivé signalizace skrze membránový receptor, ta však není předmětem této práce. terminální oblast IL 1α sice neváže receptor, ale je evolučně konzervovaná uděluje IL 1α řadu nekanonických funkcí, kterým se tato práce věnuje 1α 1α asociovat s membránami. Jaderně lokalizovaný IL 1α je terminální doménu schopný aktivovat expresi prozánětlivých genů řízených transkripčním faktorem NF κB, vázat se na histonac rázové komplexy a v rakovinných buňkách vyvolávat apoptózu. V kvasinkách byla nalezena vazba na katalytický modul histonacetyltransferázových komplexů SAGA a ADA, v lidských buňkách na komponenty homologního komplexu STAGA a Ukotvení I 1α N terminální doménou na membránu buněk slouží k prostorové lokalizaci signalizace tohoto cytokinu pouze na buňky v bezprostředním dotyku. tečně prozkoumán ani mechani mus přesunu IL 1α přes membránu, ani mechani mus kotvení 1α. Tato práce se věnuje oběma zmíněným nekanonickým funkcím. V kvasinkách popisuje 1α částečně zastoupit derepresivní funkci proteinu Snf1 na genech reprimov ných SAGA komplexem, v lidských buňkách popisuje vazbu IL 1α na nádorový supresor p53 podmínkách genotoxického stresu. V podmínkách oxidativního stresu s 1α přesunuje exinem A2, proteinem vázajícím membrány, na buněčné periferie.
|
|
|
Study on the relation between G-quadruplexes and p53-driven regulation
Holotová, Paulína ; Vodička, Juraj (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
This thesis deals with the role of G-quadruplex structures, their stabilisation using ligands and the role of p53 in transcription regulation. G-quadruplex is a type of nucleic acid secondary structure composed of 2 – 4 tetrads. Each tetrad is formed by four guanines linked by Hoogsten base pairing. This work consisted of theoretical and experimental parts. The theoretical part described the nature of G-quadruplex structures and their potential for cancer treatment, the role of p53 in the cell cycle and its regulation, and the ligands curcumin and TMPyP4 used for G4 stabilization. In the experimental part, the interactions of the curcumin and TMPyP4 with nucleic acid structures were studied. Reporter yeast strains containing PUMA, KSHV, and their combinations were transformed with plasmids encoding only selection markers and plasmids encoding the wild type form of the gene for protein p53. In the viability assay, the optimal ligand (curcumin and TMPyP4) concentration was determined for reporter yeast strain PUMA, which was further used in Luciferase assay. A fluorescence indicator displacement assay with Thioflavin T as a fluorescence dye proved the interaction between G4-forming oligonucleotides, and curcumin and TMPyP4. Luciferase assay was used to evaluate the interaction between transformed reporter yeast strains and both ligands. The results after 24 hours showed statistical significance for each strain in the same environment, where the PUMA strain showed the highest transactivation activity: the PUMA insert is a target gene for p53. Sequences with both PUMA and KSHV showed significantly lower transactivation activity, as ligands may have stabilized the G4-structure present in KSHV and thus down- regulate transcription. The presence of G4 in the KSHV sequence was also confirmed using the G4Hunter, with a G4Score of 3.182. Transactivation was significantly lower in the PUMA strains present in curcumin and TMPyP4 environment, although this sequence was not predicted to form G4, which was also confirmed in the G4Hunter analysis. This suggests that studied ligands curcumin and TMPyP4 may regulate the cell metabolism in a different than previously predicted way.
|
|
|
Analýza vazby proteinu IFI16 na DNA
Kratochvilová, Libuše ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovatelného proteinu 16 (IFI16) na DNA s potenciálem tvorby G-kvadruplexu. Protein IFI16 obsahuje dvě tandemově umístěné DNA-vazebné HIN domény vykazující rozdílnou vazbu ke strukturám DNA. Bylo prokázáno, že protein IFI16 preferenčně váže struktury G-kvadruplexů oproti jiným strukturám DNA. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární lokální struktury DNA (nebo RNA), které se snadno formují za fyziologických podmínek v řadě významných regulačních oblastech genomu, nebo jsou součástí genomů řady virů a patogenů. Schopnost rozpoznání, specifické vazby a stabilizace struktur G-kvadruplexů odráží zapojení proteinu IFI16 do buněčných procesů replikace, transkripce a translace a iniciaci vrozených imunitních odpovědí. V první části diplomové práce byly vybranými biofyzikálními metodami charakterizovány sekvence syntetických oligonukleotidů s potenciálem tvorby G-kvadruplexu a izolován protein IFI16 plné délky, který byl následně použit pro in vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty s charakterizovanými oligonukleotidy. V poslední části práce byly kvasinkové isogenní kmeny lišící se sekvencemi responzivního elementu transformovány plazmidovými vektory pro expresi proteinů p53 a IFI16 s konstitutivními i GAL inducibilními promotory a optimalizován model jednohybridního kvasinkového systému pro studium interakcí proteinu IFI16 in vivo. Z výsledků vyplývá, že většina analyzovaných sekvencí je schopna in vitro tvořit struktury G-kvadruplexu, a to i za přítomnosti pouze jednoho opakování tří a více G-bází. Zatímco přítomnost několika opakování guaninových bází oddělených jednonukleotidovým spacerem vedla k tvorbě intermolekulárních struktur G-kvadruplexů, mutace v původní sekvenci G-kvadruplexu indukovala tvorbu intramolekulárních struktur s rozdílnými konformacemi. In vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty prokázaly specifickou vazbu proteinu IFI16 ke strukturám G-kvadruplexů bez rozdílů preference vazby proteinu k určité konformaci G-kvadruplexu. Stabilizace struktur G-kvadruplexu in vivo za responzivním elementem transkripčního faktoru (p53) v promotoru reportérového genu indukovala represi transkripce daného genu. Při absenci jakéhokoliv vazebného místa proteinu IFI16 docházelo k protein-proteinové interakci mezi proteiny IFI16 a p53, která vedla ke zvýšení transaktivačního potenciálu proteinu p53, přičemž vazba proteinu p53 a iniciace transkripce reportérového genu byla ovlivněna nejen přítomností motivu G-kvadruplexu a jeho stabilizací, nýbrž i sekvencí DNA sousedící s responzivním elementem p53.
|
|
|
Characterization of protein-protein interactions between Forkhead box O (FOXO) and p53 transcription factors
Mandal, Raju ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Transkripční faktor p53 hraje klíčovou roli v regulaci buněčného cyklu, opravě DNA, apoptóze, obraně před nádorovými onemocněními a udržování buněčné homeostázy. Při buněčném stresu p53 přímo interaguje s transkripčním faktorem Forkhead box O (FOXO) 4, čímž zvyšuje expresi proteinu p21, což vede k indukci buněčné senescence. Molekulární mechanismus interakce těchto dvou klíčových transkripčních faktorů však zůstává nejasný kvůli absenci strukturních dat. Hlavním cílem této dizertační práce byla strukturní charakterizace interakce mezi FOXO4 a p53 prostřednictvím několika biofyzikálních technik včetně metody sedimentační rychlosti analytické ultracentrifugace (SV AUC), nukleární magnetické rezonance (NMR), chemického zesítění spojeného s hmotnostní spektrometrií. Dále byla studována DNA vazebná afinita obou proteinů k jejich příslušným konsenzuálním DNA sekvencím v přítomnosti nebo nepřítomnosti jejich vazebných partnerů a byl porovnán p53-vazebný povrch Forkhead domény tří různých FOXO proteinů. Připravené proteiny byly také použity pro optimalizaci nízkomolekulárních sloučenin umožňujících inhibici interakce mezi FOXO3 a DNA. Získané výsledky ukázaly, že p53 interaguje s FOXO4 prostřednictvím komplexních přechodných interakcí zahrnujících strukturované i neuspořádané oblasti obou proteinů. NMR...
|
host ::
RSS.