|
|
Synthesis and characterization of binding ligands for the study of targeted lysosomal protein degradation
Sidej, Natan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Baszczyňski, Ondřej (oponent)
Cílená degradace proteinů je novým konceptem chemické biologie, jehož základy byly položeny zhruba před 20 lety. Ústřední myšlenka konceptu spočívá v tom, že namísto potlačování aktivity vybraných proteinů pomocí jejich nízkomolekulárních inhibitorů můžeme sestrojit molekulární nástroje, kterými hostitelský organismus dokážeme donutit ke zničení těchto cílových proteinů prostřednictvím jeho přirozených degradačních drah. Tato diplomová práce se zabývá přípravou biokompatibilních polymerních konjugátů zvaných "iBodies", které budou použity pro indukci cílené lysosomární degradace dvou modelových enzymů, fibroblastového aktivačního proteinu α a glutamátkarboxypeptidasy II. V rámci této práce byly standardními metodami organické syntézy připraveny a následně plně charakterizovány celkem čtyři nízkomolekulární ligandy. První dva jsou deriváty mannosa-6-fosfonátu, které slouží jako spouštěče degradace proteinů skrze buněčnou endosomální-lysosomální degradační dráhu. Zbylé dva jsou známými a potentními inhibitory vybraných modelových enzymů, které budou v rámci této práce využity jako cílící ligandy. Připravené sloučeniny byly následně použity pro syntézu celkem osmi poly-N-(2- hydroxypropyl)methakrylamidových konjugátů zvaných iBodies. Tyto polymerní konjugáty byly následně plně charakterizovány...
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Pichová, Iva (oponent) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Optické senzory chemických látek na bázi porézního křemíku pro plynnou fázi
Liška, Jiří ; Dian, Juraj (vedoucí práce) ; Červený, Václav (oponent)
Název práce: Optické senzory chemických látek na bázi porézního křemíku pro plynnou fázi Autor: Bc. Jiří Liška Katedra: Katedra anorganické chemie Vedoucí diplomové práce: doc. RNDr. Juraj Dian, CSc. Abstrakt: Porézní křemík je nanostrukturní materiál, který je vzhledem ke svým optickým vlastnostem, zejména fotoluminiscenci a jejím zhášení v závislosti na chemických látkách v okolí, vhodným materiálem pro senzory chemických látek. Optické senzory na bázi porézního křemíku jsou nejzkoumanější skupinou senzorů a byly s úspěchem využity pro detekci chemických látek a to jak v kapalné, tak v plynné fázi. Povrch porézního křemíku je navíc možné upravovat řadou postupů, čímž jsou upraveny rozpoznávací vlastnosti. V případě kombinace více senzorových prvků různých vlastností je pak možné měřit více odezev ve fotoluminiscenčním senzorovém poli. Cíle této práce jsou: 1. Rozšíření elektrochemické charakterizace výchozích křemíkových substrátů pomocí voltametrických technik při různých světelných podmínkách v průběhu experimentu, přípravy vzorků porézního křemíku z různých typů substrátů krystalického křemíku (p-typ, n-typ), krystalografické orientace a stupně dopování. 2. Funkcionalizace povrchu porézního křemíku novými chemickými sloučeninami fo- tochemickou hydrosilylací s cílem úpravy rozpoznávacích vlastností. 3....
|
|
|
Modulation of interactions of cytokines and their receptors
Kolářová, Lucie ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
(In Czech) Protein-proteinové interakce, stejně jako interakce s dalšími molekulami například DNA a RNA, hrají důležitou roli v široké škále biologických aktivit a procesů v živých buňkách. Pochopení proteinových interakcí, nové přístupy a nástroje pro modulaci těchto interakcí jsou důležité pro medicínskou a biotechnologickou oblast výzkumu a vývoje. Jako modelový systém pro studium biologických interakcí a modulaci biologických funkcí jsme využili interleukiny z rodiny 10. Podmínkou studia biologických procesů a pochopení biomolekulárních interakcí je příprava rekombinantních proteinů, které jsou stabilní v širokém spektru podmínek. Exprese rekombinantních proteinů v dostatečném množství a kvalitě je ale často náročným úkolem. Naším cílem bylo proto vytvořit nové přístupy k produkci složitých proteinů. V této práci popisujeme modifikaci interleukinu-24 (IL-24), člena skupiny IL-10 rodiny pomocí níž jsme dosáhli zvýšení exprese a stability IL-24. Práce ukazuje, že aplikace proteinového inženýrství je vhodným nástrojem pro studium složitých proteinů. V druhé části této práce jsme se zaměřili na nové postupy v přípravě malých vazebných proteinů (skafoldů). Malé vazebné proteiny se staly ve vývoji proteinových léčiv slibnou alternativou k široce využívaným protilátkám. Nové vazebné proteiny se...
|
|
|
Targeted modifications of the protein-protein interactions: Ternary complex of interferon-γ as a model system
Zahradník, Jiří ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Klíčovým požadavkem pro detailní porozumění biologických procesů, až na molekulární úroveň, je znalost struktury interagujících molekul a jejich komplexů. Jako modelový systém, pro naši studii, jsme si zvolili IFN-γ. Ačkoliv je tato molekula jedním ze zásadních modulátorů imunitní odpovědi, a je studována již více než 60 let, tak struktura přídavného receptoru (IFN-γR2) a porozumění celému komplexu je nedostačující. V této práci jsme se nejprve zabývali binárním systémem IFN-γ s jeho receptorem, který vykazuje vysokou afinitu k IFN-γ a prostorová struktura obou dvou molekul je známa. Zaměřili jsme se tedy na modulaci afinity mezi IFN-γ a tímto receptorem. Náš přístup spočíval v inovativní metodě založené na modulaci stability protein-proteinových interakcí pomocí mutagenizace aminokyselinových zbytků umístěných uvnitř struktury proteinu. Podařilo se nám zvýšit afinitu testované interakce sedmkrát. Druhá část projektu byla zaměřena na krystalizaci, vyřešení a popis struktury druhého - přídavného receptoru pro IFN-γ. Naše analýza variabilních aminokyselinových zbytků na povrchu tohoto proteinu a strukturně příbuzných receptorů z rodiny typu II odhalila možné vazebné místo pro IFN-γ. Ve třetí části naší práce jsme se zaměřili na krystalizaci IFN-γ z platýze druhu Paralichthys olivaceus a tuto...
|
|
|
Vývoj instrumentace a metod s vysokou propustností pro hledání a validaci peptidových ligandů
Kryštůfek, Robin ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Peptidy tvoří synteticky dostupné a snadno derivatizovatelné "lešení", na jehož základě je možno vyvíjet ligandy zaměřené na široké spektrum biologických cílů. Tradiční postup k identifikaci těchto výchozích peptidů je příprava a testování kombinatoriálních knihoven. Kombinatoriální syntézu a následný screening je možné obejít využitím biologických systémů prezentace, identifikace a selekce peptidů založených na principu in vitro evoluce - tzv. display technik. V této práci je představen vývoj automatizovaných řešení obou těchto přístupů. Prvním z nich je paralelní syntetizátor peptidů SPENSER vyvinutý v rámci tohoto diplomového projektu jako nástroj k hledání a optimalizaci peptidových ligandů, stejně jako k validaci ligandů nalezených display technikami. K popisu jeho funkčních omezení bylo připraveno několik knihoven sestávajících celkem z 1 052 peptidů. Reprezentativní vzorek 154 preparací, představující 14,6 % analytické pokrytí připravených knihoven, vykazoval dle LC-MS průměrnou čistotu 67 ± 19 %. Na předložených knihovnách je ilustrováno, že SPENSER je vhodným nástrojem pro paralelní syntézu lineárních i disulfidově cyklizovaných peptidů s omezenou variabilitou, či knihoven sestávajících z krátkých peptidů. Jeho nízký rozsah reakce ve srovnání s komerčně dostupnými syntetizátory dále...
|
|
|
Návrh, příprava a charakterisace polymerních konjugátů rozeznávajících proteiny s pomocí peptidových ligandů
Kryštůfek, Robin ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Hořejší, Václav (oponent)
Protilátky jsou důležitou součástí řady laboratorních testů a klíčovými nástroji v biomedicíně. Polymerní konjugáty zvané iBodies byly navrženy jako možná alternativa k protilátkám v několika tradičně imunologických metodách. iBodies jsou založeny na methakrylamidových kopolymerech substituovaných záchytovými kotvami, reportéry a cílícími ligandy, které konjugátu propůjčují jeho specificitu. Nutnost návrh ligandu a způsobu jeho napojení pro každý zkoumaný cíl je však významnou překážkou pro generalizaci této technologie. Jednou z možných cest k překonání této překážky je vývoj konjugátů podobných sekundárním protilátkám a využití protilátek ke specifickému cílení na zkoumaný protein. Za tímto účelem byly na základě literární rešerše navrženy cyklické peptidové ligandy Fc-fragmentů protilátek se spojovacími motivy pro konjugaci s polymerním nosičem. Volné a konjugované ligandy byly srovnány na základě interakčních konstant s lidským IgG, přičemž konjugace s nosičem ve všech případech vedla ke zvýšení afinity. V závislosti na způsobu cyklizace konjugáty vykazují selektivitu vůči lidskému IgG1-4 a IgM v případě jednoduché disulfidové cyklizace peptidového ligandu, v případě N→C cyklizace je vazba na IgM potlačena. Polymery byly následně srovnány z hlediska citlivosti a selektivity pomocí tečkových...
|
|
|
Targeted modifications of the protein-protein interactions: Ternary complex of interferon-γ as a model system
Zahradník, Jiří
Klíčovým požadavkem pro detailní porozumění biologických procesů, až na molekulární úroveň, je znalost struktury interagujících molekul a jejich komplexů. Jako modelový systém, pro naši studii, jsme si zvolili IFN-γ. Ačkoliv je tato molekula jedním ze zásadních modulátorů imunitní odpovědi, a je studována již více než 60 let, tak struktura přídavného receptoru (IFN-γR2) a porozumění celému komplexu je nedostačující. V této práci jsme se nejprve zabývali binárním systémem IFN-γ s jeho receptorem, který vykazuje vysokou afinitu k IFN-γ a prostorová struktura obou dvou molekul je známa. Zaměřili jsme se tedy na modulaci afinity mezi IFN-γ a tímto receptorem. Náš přístup spočíval v inovativní metodě založené na modulaci stability protein-proteinových interakcí pomocí mutagenizace aminokyselinových zbytků umístěných uvnitř struktury proteinu. Podařilo se nám zvýšit afinitu testované interakce sedmkrát. Druhá část projektu byla zaměřena na krystalizaci, vyřešení a popis struktury druhého - přídavného receptoru pro IFN-γ. Naše analýza variabilních aminokyselinových zbytků na povrchu tohoto proteinu a strukturně příbuzných receptorů z rodiny typu II odhalila možné vazebné místo pro IFN-γ. Ve třetí části naší práce jsme se zaměřili na krystalizaci IFN-γ z platýze druhu Paralichthys olivaceus a tuto...
|
|
|
Návrh, příprava a charakterisace polymerních konjugátů rozeznávajících proteiny s pomocí peptidových ligandů
Kryštůfek, Robin ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Hořejší, Václav (oponent)
Protilátky jsou důležitou součástí řady laboratorních testů a klíčovými nástroji v biomedicíně. Polymerní konjugáty zvané iBodies byly navrženy jako možná alternativa k protilátkám v několika tradičně imunologických metodách. iBodies jsou založeny na methakrylamidových kopolymerech substituovaných záchytovými kotvami, reportéry a cílícími ligandy, které konjugátu propůjčují jeho specificitu. Nutnost návrh ligandu a způsobu jeho napojení pro každý zkoumaný cíl je však významnou překážkou pro generalizaci této technologie. Jednou z možných cest k překonání této překážky je vývoj konjugátů podobných sekundárním protilátkám a využití protilátek ke specifickému cílení na zkoumaný protein. Za tímto účelem byly na základě literární rešerše navrženy cyklické peptidové ligandy Fc-fragmentů protilátek se spojovacími motivy pro konjugaci s polymerním nosičem. Volné a konjugované ligandy byly srovnány na základě interakčních konstant s lidským IgG, přičemž konjugace s nosičem ve všech případech vedla ke zvýšení afinity. V závislosti na způsobu cyklizace konjugáty vykazují selektivitu vůči lidskému IgG1-4 a IgM v případě jednoduché disulfidové cyklizace peptidového ligandu, v případě N→C cyklizace je vazba na IgM potlačena. Polymery byly následně srovnány z hlediska citlivosti a selektivity pomocí tečkových...
|
host ::
RSS.