|
|
Prolylendopeptidasa z klíštěte Ixodes ricinus
Petrvalská, Olívia ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Klíšťata jsou významnými parazity a vektory patogenů. Na území České republiky je klíště obecné (Ixodes ricinus) nejrozšířenějším druhem, který přenáší lymskou boreliózu a klíšťovou encefalitidu. Proteasy klíšťat jsou potenciální molekulární cíle pro vývoj nových vakcín proti těmto parazitům. Tato práce se zaměřuje na biochemickou analýzu prolylendopeptidasy z klíštěte obecného, která dosud nebyla studována. Prolylendopeptidasa byla detekována v extraktu ze střevní tkáně klíštěte pomocí jednak měření enzymové aktivity a dále vizualizací na elektroforéze SDS-PAGE metodou fluorescenčního afinitního značení. Prolylendopeptidasa se pravděpodobně účastní procesu proteolytického trávení krevních proteinů, protože její specifická aktivita byla nejvyšší ve střevní tkáni a tato aktivita vzrůstala v průběhu procesu sání a zpracování potravy. Biochemická analýza ukázala, že enzymová aktivita prolylendopeptidasy je (1) závislá na volném cysteinovém zbytku v blízkosti aktivního místa, (2) optimální v oblasti pH 8-9, (3) selektivně inhibována peptidovými inhibitory Z-Ala-Pro-CMK a Z-Pro-Pro-CHO. Klíčová slova: prolylendopeptidasa, proteolýza, enzymová aktivita, substrátová specifita, klíště
|
|
|
Příprava expresních vektorů pro expresi helikasy z virů Zika a Dengue
Daňhelová, Kateřina ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Viry Zika a Dengue se vlivem globalizace rozšiřují do všech kontinentů, které leží aspoň částí v tropickém a subtropickém pásu. S jejich rozšířením souvisí i vzestup vážných onemocnění způsobených těmito viry. Řešením tohoto problému mohou být nová léčiva, jež by byla účinná proti těmto infekcím. Jejich cílem zásahu mohou být různé virové proteiny, mezi nimi i virová helikasa, kterou se zabývá tato bakalářská práce. Tématem této práce bylo připravit expresní konstrukty pro produkci rekombinantních helikas virů Zika a Dengue prostřednictvím vhodného bakteriálního kmene Escherichia coli. Byly připraveny varianty odvozené od plasmidu pET-16b s vloženou helikasou virů Zika a Dengue. Následnou purifikací byla získána helikasa viru Zika, která bude dále využita pro výzkumné účely. Klíčová slova: Flavivirus, virus Zika, virus Dengue, helikasa, exprese, purifikace, enzymová aktivita
|
|
|
Screening produkce extremozymů u vybraných extrémofilních producentů PHA
Dyagilev, Dmitry ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá screeningem produkce extraceluárních hydrolytických enzymů u termofilních mikroorganismů rodů Aneurinibacillus, Brevibacillus, Chelatococcus Pseudomonas, Schlegelella, Tepidimonas a Caldimonas. U zkoumaných mikroorganismů byla testována schopnost produkce vybraných enzymů, konkrétně proteáz, lipáz, amyláz, xylanáz, celuláz a pektináz. Takové testování dalo možnost posoudit, u kterých mikroorganismů je možné pozorovat produkci konkrétních enzymů. Na základě výsledků screeningu bylo zjištěno, že Schlegelella aquatica LMG 23380, Tepidimonas fonticaldi LMG 26746 a zkoumané mikroorganismy z rodu Chelatococcus neprojevily schopnost extracelulárně produkovat žádný z testovaných enzymů. U přírodních izolátů Brevibacillus borstelensis LK 99 a Aneurinibacillus thermoaerophilus LK 102 byla detekována pouze schopnost produkce lipolytických enzymů. Jako univerzální producent všech vybraných extremozymů vystupuje izolát Brevibacillus borstelensis Bz. U vybraných producentů bylo provedeno stanovení aktivity enzymů. Bakterie Brevibacillus borstelensis Bz dokázala schopnost produkce všech šesti vybraných hydrolytických enzymů a také má nejvyšší aktivitu lipáz, xylanáz, celuláz a pektináz z testovaných mikroorganismů. Nejvyšší proteolytickou aktivita byla naměřena u bakterie Thermomonas hydrothermalis DSM 14834 při kultivaci na odstředěném sušeném mléce.
|
|
|
The role and function of stromal enzymes in keratoconus pathogenesis
Ďuďáková, Ľubica ; Jirsová, Kateřina (vedoucí práce) ; Svozílková, Petra (oponent) ; Ardan, Taras (oponent)
Lubica Dudakova Doctoral Thesis ABSTRAKT Keratokonus (KC) je nezánětlivé onemocnění rohovky, při kterém se rohovka ztenčuje a vyklenuje pravděpodobně v důsledku poruch ve vazbě kolagenních vláken. Je jednou z nejčastějších indikací k transplantaci rohovky. KC je multifaktoriální onemocnění, na jehož vzniku se podílí i genetické faktory, nicméně přesná příčina onemocnění ani její mechanismus nebyly zatím objasněny. Cílem práce bylo porovnat výskyt a aktivitu enzymů lysyl oxidáz (LOX a LOX-like enzymy), které katalyzují vznik vazeb mezi elastinovými a kolagenními vlákny v kontrolních lidských rohovkách a v explantátech získaných při transplantaci od pacientů s KC. Zaměřili jsme se i na onemocnění asociované s výskytem KC a pokusili se najít jejich společné znaky. Provedli jsme studii ověřující asociaci jednonukleotidovych záměn (SNPs) v genech pro LOX a hepatocytární růstový faktor (HGF) s výskytem KC. V našem výzkumu jsme použily metody buněčné a molekulární biologie (tkáňové kultury, imunohisto- a imunocytochemie, mikroskopie, měření aktivity enzymů pomocí fluorometrie, genotypování a přímé sekvenování) a statistickou analýzu. Prokázali jsme přítomnost celé rodiny lysyl oxidáz v kontrolní i KC rohovce, ve které jsme pozorovali pokles intenzity a nepravidelné rozmístění LOX, propeptidu LOX, LOXL2 a LOXL3....
|
|
|
Optimalizace metody stanovení enzymové aktivity flavinových monooxygenas
Hovorková, Adéla ; Dračínská, Helena (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Flavinové monooxygenasy, jako biotransformační enzymy katalyzující oxidaci širokého spektra cizorodých látek v organismech, byly dlouho v porovnání s cytochromy P450, rozsáhlejší skupinou biotransformačních enzymů, přehlíženy. Ke studiu metabolismu cizorodých látek se často užívají jaterní mikrosomy, které obsahují oba zmíněné biotransformační enzymy. Jejich katalytická aktivita se může z důvodu potřeby stejných kofaktorů překrývat, a proto je potřebné je vhodně rozlišit. Tato bakalářská práce se zabývá optimalizací metody pro stanovení enzymové aktivity flavinových monooxygenas v jaterních potkaních mikrosomech. Modelovou reakcí pro optimalizaci metody byla oxidace methyl-p-tolylsulfidu na methyl-p-tolylsulfoxid. Pro stanovení aktivity byly stanoveny nejvhodnější podmínky: prostředí o pH 9,5, 2mM methyl-p- tolylsulfid a 10minutová doba inkubace. Bylo zjištěno, že na oxidaci methyl-p-tolylsulfidu se podílejí i cytochromy P450, izoforma 1A1 nejvíce. Testovány byly i různé inhibitory obou výše zmíněných biotransformačních enzymů (kyselina lipoová, methimazol, Brij 35 a Triton X-100). Jako vhodný inhibitor katalytického účinku cytochromů P450 byl vybrán Brij 35, který neměl na rychlost oxidace katalyzovanou flavinovými oxygenasami žádný vliv. V závěru práce byla z prozatím neznámého důvodu opakovaně...
|
|
|
Sledování enzymové aktivity myrosinasy pomocí kapilární elektroforézy v off-line a on-line uspořádání
Orgoníková, Andrea ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kubíčková, Anna (oponent)
3 Abstrakt Glukosinoláty jsou sekundární produkty rostlin, které jsou hydrolyzovány enzymem myrosinasou, za vzniku toxických produktů, jako jsou například isothiokyanatany. Tyto produkty degradace se podílejí na obraně rostliny proti vnějším patogenům. Tato bakalářská práce se zabývá sledováním enzymové aktivity myrosinasy pomocí kapilární elektroforézy. Jako substrát enzymové reakce byl zvolen 3-indolylmethylglukosinolát známý pod triviálním názvem glukobrassicin. V rámci experimentů byla vyzkoušena enzymová reakce jak v off-line, tak i on-line uspořádání kapilární elektroforézy. Jako základní elektrolyt byl použit roztok obsahující 9 mM tetraboritan sodný, 15 mM kyselinu fosforečnou a 10 mM hexadecyltrimethylammonium chlorid (pH = 7,02). Vzorek byl dávkován hydrodynamicky tlakem (5 kPa, 3 s). Na kapiláru bylo vkládané napětí -20 kV a roztok v kapiláře byl zároveň mobilizován tlakem 5 kPa. Optimalizovaná metoda byla vyhodnocena změřením kalibrační závislosti, meze detekce, meze stanovitelnosti, opakovatelnosti měření pro dávkování glukobrassicinu v off-line i on-line uspořádání a opakovatelnosti on-line enzymové reakce. Hodnota meze detekce byla stanovena na 0,011 mg ml-1 a hodnota meze stanovitelnosti na 0,035 mg ml-1 . V off-line i on-line uspořádání byly relativní směrodatné odchylky pro plochy píků...
|
|
|
Hydrogely s inkorporovanými enzymy
Geistová, Karolína ; Krouská, Jitka (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem inkorporace enzymů do fázově separovaných hydrogelů. Cílem práce bylo stanovit enzymovou aktivitu ve fázově separovaných gelech. Gely byly připraveny metodou suché cesty na základě interakce záporně nabitého polyelektrolytu (hyaluronan) s kladně nabitým tenzidem (Septonex). K inkorporaci do hydrogelů byly použity dva enzymy, a to bromelain a kolagenasa, a ke stanovení jejich enzymové aktivity byl jako substrát použit modifikovaný protein albumin s navázanou sulfanilamidovou skupinou (azoalbumin). Ke zjištění enzymové aktivity samotného enzymu, enzymové aktivity ovlivněné jednou ze dvou složek systému a enzymové aktivity přímo v hydrogelu, byla použita metoda UV-VIS spektrofotometrie. Bylo zjištěno, že enzym lze inkorporovat do hydrogelu. Dále bylo zjištěno, že kladně nabitý tenzid má značný vliv na hodnotu aktivity enzymu ve fázově separovaných hydrogelech.
|
|
|
Vliv mebendazolu na aktivitu vybraných enzymů u tasemnice Hymenolepis diminuta
Lukačiková, Karolína ; Vokřál, Ivan (vedoucí práce) ; Skálová, Lenka (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Karolína Lukačiková Školitel: PharmDr. Ivan Vokřál, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv mebendazolu na aktivitu vybraných enzymů u tasemnice Hymenolepis diminuta Helmintorezistence je stále se rozšiřující celosvětový fenomén a znepokojující problém. Enzymy metabolizující xenobiotika hrají významnou roli v rozvoji rezistence, jelikož mohou snížit koncentraci anthelmintika v těle parazita a tak parazita ochránit před anthelmintickým účinkem. Role enzymů metabolizujících xenobiotika v rozvoji lékové rezistence byla již studována a popsána u hlístic a motolic. U tasemnic je však k dispozici o této problematice pouze omezené množství informací. V naší studii jsme se proto rozhodli ověřit, zda anthelmintikum mebendazol může ovlivnit u modelové tasemnice krysí (Hymenolepis diminuta) aktivity enzymů metabolizujících xenobiotika a tím pádem ovlivnit i rozvoj lékové rezistence. Naším prvním cílem byla izolace jedinců tasemnice krysí z definitivního hostitele (potkan, Rattus norvegicus). Jako mezihostitele jsme použili potemníka moučného (Tenebrio molitor). Po úspěšné izolaci byly tasemnice po dobu 24 hodin inkubovány s mebendazolem (1 a 10µM) v médiu RPMI-1640 (5 % CO2, 37 řC). Následně byly připraveny...
|
|
|
Vliv albendazolu na aktivitu vybraných enzymů u tasemnice Hymenolepis diminuta
Krejzová, Andrea ; Vokřál, Ivan (vedoucí práce) ; Szotáková, Barbora (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Andrea Krejzová Školitel: PharmDr. Ivan Vokřál, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv albendazolu na aktivitu vybraných enzymů u tasemnice Hymenolepis diminuta Účinnost anthelmintik, používaných pro terapii onemocnění způsobených helminty, není vždy dostačující a v některých případech se setkáváme přímo s rezistencí na tato léčiva. Helminti, mezi něž patří i tasemnice, se dokáží toxickému vlivu anthelmintik bránit pomocí řady mechanismů. Mezi tyto mechanismy patří také enzymy metabolizující xenobiotika a transportní proteiny. Jsou-li enzymy metabolizující xenobiotika indukovány, může být účinnost terapie významně snižována. Vliv xenobiotika metabolizujících enzymů na vznik rezistence u řady helmintů je již znám a popsán. U tasemnic dosud tyto informace schází. Hlavním cílem této práce bylo stanovení vlivu albendazolu na aktivitu vybraných xenobiotika metabolizujících enzymů tasemnice krysí (Hymenolepis diminuta). Tasemnice byly inkubovány s albendazolem (1 μM a 10 μM) po dobu 24 hodin. Následně byly stanoveny v cytosolické, mikrosomální a mitochondriální frakci aktivity vybraných enzymů. V této práci jsme se zaměřili na aktivitu karbonylreduktasy, dvě isoformy aldoketoreduktasy (AKR1C a AKR1A1),...
|
|
|
Exprese a aktivita potkaních cytochromů P450 3A po podání benzo[a]pyrenu a Sudanu I
Ličko, Vojtech ; Dračínská, Helena (vedoucí práce) ; Ptáčková, Renata (oponent)
Cílem této bakalářské práce je studium vlivu kancerogenů benzo[a]pyrenu a Sudanu I podávaných laboratorním potkanům samostatně nebo společně na expresi a aktivitu významného biotransformačního enzymu cytochromu P450 podrodiny 3A v játrech - hlavním orgánu metabolismu xenobiotik, ve kterém je obsah CYP3A zvlášť vysoký. Pomocí metody kvantitativní PCR jsme pozorovaly pokles exprese genů CYP3A v játrech laboratorních potkanů nepremedikovaných a premedikovaných benzo[a]pyrenem, Sudanem I a jejich kombinacemi. Metodou Western Blot s následnou imunodetekcí jsme i na proteinové úrovni pozorovaly podobnou tendenci poklesu exprese CYP3A v játrech potkanů vystavených samostatně podanému benzo[a]pyrenu a Sudanu I. Specifická aktivita CYP3A, stanovená markerovou reakcí CYP3A, kterou je 6β- hydroxylace testosteronu, však předchozí výsledky potvrzuje jen u některých skupin premedikovaných potkanů. Celkově lze shrnout shrnout, že vystavení laboratorních potkanů oběma studovaným látkám s kancerogenním potenciálem vedlo k poklesu exprese jaterních CYP3A in vivo. Klíčová slova: cytochromy P450, benzo[a]pyren, Sudan I, exprese, enzymová aktivita
|
host ::
RSS.