|
|
Regulation of intracellular calcium levels as tool to control NK cell cytotoxicity.
Graman, Vojtěch ; Frič, Jan (vedoucí práce) ; Šimíček, Michal (oponent)
NK buňky, podskupina přirozených lymfoidních buněk, hrají klíčovou roli při rozpoznávání a eliminaci virem infikovaných a rakovinných buněk, což z nich činí slibnou buněčnou imunoterapii pro pacienty trpící AML. Imunoterapie založené na NK buňkách však čelí nepředvídaným problémům s účinností. Ukázalo se, že intracelulární Ca2+ signalizace hraje klíčovou roli pro cytotoxicitu NK buněk. Udržování složité rovnováhy intracelulární Ca2+ signalizace je životně důležité pro NK buňkami zprostředkované zabíjení cílových buněk. V komplexním mikroprostředí těla pacienta se NK buňky setkávají s různými podněty, které mohou potenciálně narušit rovnováhu intracelulární Ca2+ signalizace. Ukázalo se, že stimulace PRR ovlivňuje intracelulární Ca2+ a tak i celkovou cytotoxicitu NK buněk. Tato studie zkoumala dopad stimulace TLR na signalizaci Ca2+ a funkce NK buněk. Účinek stimulace TLR byl hodnocen měřením influxu intracelulárního Ca2+ , funkčního cytotoxicitckého a degranulačního testu, stejně jako analýzy genové exprese. Expozice TLR ligandům měla za následek zvýšení intracelulárních hladin Ca2+ , doprovázené snížením cytotoxické aktivity v nízkých poměrech efektorů k cílovým buňkám. Byl pozorován rostoucí trend v degranulaci. Kromě toho analýza genové exprese odhalila zvýšení exprese NFAT a Orai1 u NK buněk...
|
|
|
Structural biochemistry of protein NKp80, an activation receptor of human lymphocytes
Pazderová, Kristýna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent)
NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky) buňky hrají důležitou roli při rozpoznání a eliminaci infikovaných, poškozených či nádorových buněk bez nutnosti předchozího kontaktu s nimi. Jejich cytotoxicita je zprostředkována aktivačními receptory na jejich povrchu, jako je receptor NKp80 (z angl. Natural Killer protein 80 kDa). NKp80 se váže na ligand AICL, který je konstitutivně exprimován na myeloidních buňkách. Zvýšená exprese AICL, např. na nádorových buňkách, vede k aktivaci NK buněk exprimujících receptor NKp80. Interakce NKp80:AICL je proto slibným imunoterapeutickým cílem pro léčbu myeloidní leukémie. Struktura obou proteinů dosud nebyla známá, a proto jsme se v práci zaměřili na úspěšnou produkci extracelulární domény těchto proteinů za tímto účelem. Při produkci receptoru NKp80, jsme zavedli do "stalk" oblasti sérii mutací, kde byly jednotlivé cysteiny nahrazeny seriny. Pomocí zavedených mutací jsme studovali jejich vliv na produkci, stabilitu a tvorbu homodimeru. Zavedené mutace významně zvýšily výtěžek produkce, a proto byl protein připraven ve větším množství za účelem krystalizace proteinu. Krystalizace vedla k objasnění dosud neznámé struktury homodimeru NKp80 s rozlišením 2,9 Å. Při přípravě proteinů ke krystalizaci bylo ovšem zjištěno, že dochází k částečné...
|
|
|
Cytokinové sítě a jejich dopad na imunitní profil pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML)
Ptáček, Antonín ; Musil, Jan (vedoucí práce) ; Fišer, Karel (oponent)
Akutní myeloidní leukémie (AML) je maligní hematologické onemocnění projevující se expanzí blastů v kostní dřeni a do periferní krve. Imunitní systém chrání tělo před leukémií odstraňováním transformovaných buněk. V AML jsou ale schopnosti imunitních buněk ovlivněny jak přímým kontaktem mezi leukemickými a efektorovými buňkami, tak cytokiny, metabolity a dalšími solubilními proteiny, které spolu s buňkami tvoří specifické mikroprostředí AML. Efekty cytokinů a dalších solubilních molekul v mikroprostředí AML nejsou zatím dostatečně popsány. Tato práce měla za cíl optimalizovat a zavést panel pro multiparametrickou průtokovou cytometrii pro měření buněčných populací a zavést multiparametrické testy hladin cytokinů, chemokinů a dalších solubilních proteinů v plazmě. Dalším cílem pak bylo pomocí těchto metod charakterizovat frekvence a funkční fenotyp buněčných populací a hladiny solubilních proteinů v mikroprostředí AML a popsat jejich vliv na závažnost onemocnění a celkové přežití pacientů. Pokusili jsme se také nalézt nové biomarkery imunitního úniku leukemických buněk. U pacientů jsme pozorovali supresivní mikroprostředí s aberantními hladinami solubilních receptorů a dalších proteinů. Toto mikroprostředí pak bylo odlišné v jednotlivých prognostických skupinách, do kterých byli pacienti rozděleni....
|
|
|
The role of γc cytokines in the immune system and cancer immunotherapy
Ptáček, Bohumil ; Kovář, Marek (vedoucí práce) ; Adkins, Irena (oponent)
Cytokiny jsou proteiny produkované především buňkami hematopoetického původu, které poskytují signály zprostředkované specifickými receptory. Tyto receptory jsou exprimovány buďto na buňkách produkujících cytokiny (autokrinní signalizace), nebo jsou na povrchu jiných cílových buněk (parakrinní signalizace). Cytokiny sdílející obecnou cytokinovou receptorovou podjednotku (γc) jsou malé glykoproteiny patřící do skupiny cytokinů typu I, mají různorodé účinky jak na vrozený, tak i na adaptivní imunitní systém. Všechny γc cytokiny sdílejí ve svých kompletních receptorech podjednotku γc. První část této práce se zaměřuje na shrnutí základních poznatků o biologii těchto cytokinů, jejich receptorech a roli v imunitním systému. Druhá část práce se zabývá využitím γc cytokinů v nádorové imunoterapii, předkládá příklady konkrétních terapií, popisuje nové možnosti a přístupy ve zlepšení farmakologických vlastností γc cytokinů i případné možnosti kombinace γc cytokinové imunoterapie s dalšími imunoterapiemi či protinádorovou léčbou. Klíčová slova: γc cytokin, cytokinový receptor, T lymfocyt, NK buňka, nádorová imunoterapie
|
|
| |
|
|
Rekombinantní příprava receptorů potkaních NK buněk v expresním systému HEK293T.
Celadová, Petra ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
NK buňky hrají důležitou roli v imunitní odpovědi proti nádorovým a virově infikovaným buňkám. Exprimují široké spektrum různých povrchových receptorů, mezi které patří také NKRP1. Jedná se o rodinu C-lektinových receptorů, která zahrnuje receptory jak s inhibiční, tak s aktivační funkcí. Poměrně nedávno byly pro některé molekuly z této rodiny nalezeny ligandy, které patří taktéž do nadrodiny C-lektinových receptorů . Jedná se mj. o potkaní Clr-b, fyziologický ligand pro NKRP1B. Bylo zjištěno, že inhibiční funkce receptorového komplexu NKRP1B-Clr-b může být nabourána proteinem potkaního cytomegaloviru RCTL, virové verze Clr-b, která slouží jako falešný ligand pro NK buňky. Cílem mé diplomové práce bylo klonování a příprava zmíněných C-lektinových receptorů v transientně transfekované HEK293T buněčné linii v suspenzní kultuře. Tento expresní systém umožňuje získat proteiny s uspokojivým výsledkem, a to v jejich nativní konformaci, čímž je odstraněna potřeba časově náročných a často bezvýsledných pokusů o renaturaci proteinů připravených pomocí bakteriálního expresního systému v E. coli. Úspěchu bylo dosaženo v případě Clr-b a NKRP1B receptorů potkaních kmenů WAG i SD. Proteiny byly purifikovány za pomoci chelatační chromatografie následované gelovou filtrací, identifikovány hmotnostní spektrometrií a...
|
|
|
Studium interakce lektinových receptorů přirozených zabíječů s jejich proteinovými ligandy.
Hernychová, Lucie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
NK buňky jsou přirozené lymfocyty, které tvoří díky svému receptorovému systému první linii obrany organismu před infekcemi. Jsou důležitou součástí protivirové, ale také protinádorové imunity, hrají roli v transplantační imunitě, autoimunitě nebo reprodukci. Tato diplomová práce se zabývá studiem struktury membránového receptoru NKR-P1B myších NK buněk a jeho interakcí s ligandem Clr-b. Cílem bylo připravit expresní vektor kódující ligand-vazebnou a celou extracelulární část receptoru NKR-P1B a optimalizovat jeho produkci a renaturaci in vitro. Připravené proteiny byly analyzovány gelovou filtrací, elektroforeticky a hmotnostní spektrometrií. Poté byla sledována jejich interakce s proteinem Clr-b biofyzikálními (gelová filtrace a povrchová plazmonová rezonance) a biologickými metodami (značení buněčných preparátů proteiny NKR-P1B s navázanou fluorescenční sondou). In vitro vazebné pokusy nepotvrdily vzájemnou intarakci NKR-P1B a Clr-b, přestože se připravené proteiny vázaly na buňky z kostní dřeně.
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
Strukturní biologie komplexu potkaních NK buněčných receptorů NKR-P1B a Clrb
Dvorská, Anna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
NK buňky mají důležitou roli v nespecifické imunitě organismů. Jejich schopností je rozpo- znat a zabít nádorové a virově infikované buňky bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je usměrňována množstvím stimulačních a inhibičních receptorů interagujících s li- gandy na cílové - nádorové či infikované buňce. Tato práce se zabývá přípravou a studiem komplexu potkaního NK buněčného inhibičního receptoru NKR-P1B ("natural killer cell re- ceptor - protein 1B") a jeho ligandu Clrb ("C-type lectin-related ligand b"). Clrb spouští inhibici NKR-P1B, což znamená, že pokud buňka exprimuje Clrb, nebude zničena. Při in- fekci potkaním cytomegalovirem ztrácí buňka ze svého povrchu Clrb a není tedy zabráněno jejímu zničení. Buňky infikované tímto virem se brání zničení pomocí exprese virového genu C-lektinového typu RCTL, jenž je homologem Clrb. Pro rekombinantní přípravu rozpustné formy těchto dvou receptorů potkaních NK bu- něk byla použita tranzientní transfekce linie lidských embryonálních ledvinných buněk 293 s jednoduchou glykosylací (HEK293S GnTI− ). Nativní formy receptorů - disulfidicky vázané homodimery - byly připraveny jako fúzní konstrukty s IgG Fc (s pomocí vektoru pYD5), které po odštěpení TEV proteasou poskytují čistě dimerní formu extracelulární části re- ceptorů bez jakékoliv afinitní...
|
|
|
Studium interakce receptoru NKp46 s adhesinem Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Jednou ze složek nespecifického imunitního dohledu organismu jsou NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky). Úkolem NK buněk je vyvolat apoptosu u cílových buněk (například buněk rakovinných či virově infikovaných). Cílové buňky jsou rozpoznávány pomocí povrchových receptorů. NK buňky mají na svém povrchu aktivační a inhibiční receptory. Mezi aktivační receptory patří receptor přirozené cytotoxicity NKp46. Jedním z několika dosud popsaných ligandů tohoto receptoru je adhesin Epa1 (z angl. epithelial adhesin 1) kvasinky Candida glabrata. Neschopnost těla spustit imunitní odpověď a bránit se kvasinkové infekci způsobuje vážné komplikace u pacientů s hematologickým onemocněním, tzv. invazivní kandidózy. NK buňky se začínají využívat také v rámci imunoterapie nádorů, konkrétně bispecifické fúzní proteiny, které se jednou částí váží na receptor NK buňky a druhou částí na nádorový antigen. Tato práce se zaměřuje na přípravu rekombinantního proteinu NKp46. Pro studium vlivu O-glykosylace na vazbu ligandu byl připraven mutant glykosylačního místa NKp46 T225A. Proteiny byly produkovány stabilně transfekovanými liniemi HEK293S GnTI- a HEK293T. Protein Epa1 byl produkován v expresním systému E. coli a poté purifikován. Schopnost vazby proteinu Epa1 a laktosy byla ověřena pomocí dvou...
|
host ::
RSS.