|
|
Non-enzymatic roles of kinases and phosphatases - the case of MTMR9 and AAK1
Knop, Filip ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Harnoš, Jakub (oponent) ; Soukup, Vladimír (oponent)
Enzymatické role kináz a fosfatáz v regulaci buněčných procesů byly popsány na mnoha příkladech. V posledních letech se objevuje rostoucí počet případů postradatelnosti katalytické aktivity těchto enzymů. Tato práce se soustředí na dva konkrétní proteiny, savčí MTMR9 a SEL-5/AAK1 v háďátku obecném. MTMR9 z rodiny lipidových fosfatáz příbuzných myotubularinu (MTMR) patří do skupiny pseudofosfatáz, které jsou charakteristické nepřítomností enzymatické aktivity. Na druhou stranu, SEL-5/AAK1 je typickou aktivní kinázou s nejméně dvěma známými substráty. Podařilo se nám zjistit důležitost MTMR9 v časné sekretorní dráze buňky, kde kolokalizuje s markery intermediálního kompartmentu mezi endosomálním retikulem a Golgiho aparátem (ERGIC). Dále jsme identifikovali několik možných interakčních partnerů, například RAB1 a MTMR6, jejíchž lokalizaci a/nebo aktivitu by mohla vazba na MTMR9 regulovat. Změna úrovně MTMR9 způsobila narušení WNT3A sekrece a následně vedla k redukci aktivity Wntové signální dráhy. Pro SEL-5/AAK1 se nám podařilo identifikovat dva procesy, oba taktéž regulované Wntovou signální dráhou, které jsou důležité ve vývoji háďátka obecného. Jednak je SEL-5 společně s několika členy retromerového komplexu zodpovědný za regulaci správné QL.d migrace, a jednak SEL-5 reguluje růst exkretorních...
|
|
|
Vizualizace značených buněk modelového organismu
Kubíček, Radek ; Kršek, Přemysl (oponent) ; Herout, Adam (vedoucí práce)
Tato diplomová práce, zabývající se zobrazením volumetrických (objemových) dat, má za úkol zobrazit a zvýraznit značené buňky modelových organismů v datech sejmutých konfokálním mikroskopem. Vstupní data tvoří jednolitý volumetrický celek složený z jednotlivých řezů, který je nutno vhodnou metodou zobrazit a poté identifikovat a zvýraznit buňky označené metodou GFP (Green Fluorescent Protein) nebo fluoreskováním chlorofylu. Hlavním cílem této práce je nalézt pokud možno optimální efektivní metodu umožňující toto zvýraznění, pracující ideálně bez manuálního zásahu uživatele. Vzhledem ke struktuře dat je však tento cíl jen těžko splnitelný, proto postačí nalezení metody operující v manuálním režimu. Nakonec je třeba dosažené výsledky práce zaintegrovat do nástroje FluorCam pro zobrazování dat z dekonvolučního konfokálního mikroskopu.
|
|
|
Mechanical forces in asymmetric cell division
Šabata, Vojtěch ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Middelkoop, Teije Corneel (oponent)
Buněčné dělení je jedním z nejvíce studovaných témat v oborech buněčné a molekulární biologie. V některých případech mohou buňky využít různé mechanismy k ovlivnění běžné funkce jejich dělícího aparátu k tomu, aby se rozdělily asymetricky. To má za následek dvě dceřiné buňky lišící se od sebe navzájem určitým způsobem, což je nezbytný předpoklad pro vývoj a homeostázu komplexních mnohobuněčných organismů. Tato práce je zaměřena na dělení zygoty Caenorhabditis elegans, klasického příkladu asymetrického dělení. Na tomto modelovém systému práce shrnuje buněčné mechanismy používané pro ustanovení polarity s důrazem na přítomné, čistě mechanické aspekty. V posledních letech byl učiněn velký pokrok v popisu těchto základních drah, které jsou ve svém jádře vysoce konzervovány od háďátka po člověka. Hlubší znalost těchto procesům, které jsou obecně zodpovědné za úspěšné buněčné dělení, může být prospěšná pro lepší pochopení vývoje organismů ve stavech zdraví a nemoci.
|
|
|
Příprava konstruktů pro analýzu exprese jaderného receptoru nhr-97 pomocí transgenních technik v modelovém systému Caenorhabditis elegans
Boušová, Kristýna ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
Cílem této bakalářské práce bylo připravit dva konstrukty promotoru regulující expresi genu kódujícího jaderný hormonální receptor nhr-97 u C. elegans. Jaderné receptory patří do velké skupiny genů sdílících homologní sekvence s jadernými receptory některých obratlovců. První, teoretická část práce popisuje strukturu jaderných hormonálních receptorů, jejich funkci a význam u nematod C. elegans. Dále je popsán samotný modelový organismus C. elegans, jeho anatomie, životní cyklus a genom. Práce také pojednává o struktuře a využití zeleného fluorescenčního proteinu (GFP), sloužícího k lokalizaci exprese genu nhr-97 v C. elegans. V praktické části je uveden postup přípravy dvou konstruktů promotoru: izolace genomové DNA ze C. elegans, amplifikace promotorů pomocí PCR a jejich následné klonování do vektoru pPD95.67 obsahujícího gen kódující zelený fluorescentní protein. Pro ověření úspěšného naklonování konstruktů promotoru bylo provedeno sekvenování DNA. Klonované promotory nhr-97 budou použity k mikroinjekcím do gonád C. elegans a exprese tohoto genu z jeho jednotlivých promotorů bude sledována pomocí exprese zeleného fluorescenčního proteinu v potomcích.
|
|
|
The role of CUP-4 protein in Wnt signalling
Žídek, Radim ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Pospíchalová, Vendula (oponent)
Wnt signalizace je nezbytná pro správný vývoj organismů a zachování homeostáze v dospělosti. Její narušení je častou příčinou onemocnění. U háďátka Caenorhabditis elegans řídí Wnt signalizace celou paletu vývojových procesů, mezi něž patří také migrace Q neuroblastů a jejich dceřinných buněk. Jediný Wnt, který se podílí na tomto procesu, EGL-20, spouští kanonickou dráhu přenosu Wnt signálu přes β-katenin v QL, ale nikoliv v QR neuroblastu, což vede k tomu, že QL zůstane v zadní části těla, zatímco QR migruje anteriorně. Tato migrace představuje užitečný nástroj pro studium Wnt signalizace. Nedávno bylo zjištěno, že také mutace genu cup-4 způsobuje poruchu migrace QL neuroblastu u malé části mutantní populace. cup-4 kóduje protein z rodiny ligandem ovládaných iontových kanálů, který se podílí na endocytóze v coelomocytech, specializovaných fagocytických buňkách v tělní dutině C. elegans. V této práci uvádím výsledky mé snahy o umístění CUP-4 do Wnt signalizace a objasnění mechanismu jeho fungování. Zjistil jsem, že CUP-4 je v signální dráze zapotřebí dříve než PRY-1/Axin, který se účastní přenosu signálu v cílových buňkách, a pravděpodobně později než adaptin AP2, který je důležitý pro opětovné využití proteinu Wntless (Wls), receptoru sloužícího k dopravě Wnt proteinu ve Wnt produkujících buňkách....
|
|
|
Regulace exprese proteinů nespecifické imunity u Caenorhabditis elegans.
Kaštánková, Iva ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Cmarko, Dušan (oponent)
5 Abstrakt Lipopolysacharidy, molekuly tvořené lipidy s kovalentně navázanými sacharidy, jsou charakteristickou složkou buněčné stěny gramnegativních bakterií. Je přičinou těžkých septických stavů u člověka a tím i komplikací v humánní medicíně Lipopolysacharid je konstantní součástí infekce gramnegativních bakterií, proto předpokládáme evolučně zachovalou nespecifickou imunitní odpověď a ochrany. Otázkou je, zda existuje tato imunitní odpověď u modelového organismu Caenorhabditis elegans. Pokud ano, jakým mechanismem je řízena a regulována. Mnohobuněčnému organismu Caenorhabditis elegans jsme podali lipopolysacharid bakterie Pseudomonas aeruginosa 10 v kombinaci s bakteriemi Escherichia coli. Pozorovali jsme vliv lipopolysacharidu na expresi vybraných genů. Dále jsme sledovali metabolismus a vývoj organismu. Prokázali jsme vliv lipopolysacharidu na expresi genů z rodin C-typy lecitinů, clec-60 a clec-71, dále na lys-5, hsp-60 a F44G.3.2.1. Po inkubaci Caenorhabditis elegans na komponentách lipopolysacharidu jsme zjistili regulaci těchto vybraných genů hydrofobní lipidní složkou lipopolysacharidu, lipidem A. Překvapivě regulaci sacharidovými složkami, glukosou a galaktosou jsme neprokázali. Změnil se metabolismus lipidů. Prokázali jsme snížení neutrálních tuků a změny v zastoupení některých mastných...
|
|
|
Studium exprese jaderného receptoru nhr-97 v Caenorhabditis elegans
Boušová, Kristýna ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Jaderné hormonální receptory (NHR) patří mezi důležité transkripční faktory, které regulují vývoj a metabolismus u velké části živočichů. Caenorhabditis elegans obsahuje 284 jaderných receptorů, což je neobvykle velké množství oproti receptorům nalezeným u Drosophila melanogaster (18) a u člověka (48). Patnáct z těchoto receptorů C. elegans má homologní strukturu s receptory D. melanogaster a se savci. Zbylých 269 NHR jsou specifické pouze pro hlístice a patří do skupiny tzv. doplňkových jaderných receptorů (SupNRs), jejichž evolučním předchůdcem je HNF4 - důležitý transkripční faktor u člověka. V této práci jsme popsali jaderný hormonální receptor nhr-97, jehož exprese a funkce dosud nebyly studovány. Gen je kódován v genomu C. elegans a patří mezi SupNRs. Nhr-97 tvoří dvě isoformy A a B, jejichž exprese je v tkáních C. elegans odlišná. Lokalizace exprese genu in vivo byla určena pomocí transgenních linií exprimujících nhr-97::GFP. Pro isoformu A byla exprese nhr-97 lokalizována v neuronech v oblasti hltanu a v oblasti ocásku, ve střevě a v hypodermis, pro isoformu B v hltanu, v neuronech okolo korpusu hltanu, v hlavové mesodermální buňce a v análním svěrači. Exprese nhr-97 během vývoje C. elegans byla stanovena pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR). Zjistili jsme, že mRNA...
|
|
|
Gene expression regulation by nuclear receptors in a specific metabolic context - evolutionary perspective
Kaššák, Filip ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent) ; Leontovyč, Ivan (oponent)
Mezi nejdůležitější regulátory genové exprese u zvířat patří jaderné receptory (NRs) a jejich koregulátory, zejména Mediátorový komplex. Zvláštní zájem vzbuzují NRs zúčastňující se na metabolické a vývojové regulaci a na karcinogenesi: receptory hormonů štítné žlázy (TRs) a retinoidové X receptory (RXRs). Ve své práci se podjímám úkolu objasnit některé aspekty regulace genové exprese těmito NRs: míru evoluční konzervace jejich signalizačních drah; mechanismy negativní regulace jadernými receptory; a možné aplikace těchto objevů v klinické medicíně. Použil jsem bioinformatické a mikroskopické metody, včetně metod genové editace, a to na třech úrovních evoluce zvířat ke studiu vtahu NRs a Mediátoru. Reversní genomická analýza u lidských pacientů trpících syndromem rezistence k thyroidním hormonům je využita k posouzení struktury a funkce subdomén TRβ. Porovnání sekvencí, vázné studie a in vivo experimenty u Trichoplax adhaerens vedly k identifikaci blízkého ortologu lidského RXR na počátku evoluce zvířat. Použitím analýzy databází, editace genomu a mikroskopie jsme identifikovali skutečný ortolog mediátorové podjednotky 28 u Caenorhabditis elegans, což poukazuje na zásadní homologii Mediátorového komplexu mezi nematody a člověkem. Analýza vztahu mezi druhy posiluje koncept konzervace regulační osy...
|
|
|
Úloha fosfatidylinositol-4-fosfát 5-kinázy PPK-1 v regulaci signální dráhy proteinu Wnt u Caenorhabditis elegans
Zavadilová, Kristýna ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Kostrouch, Zdeněk (oponent)
Signální dráha proteinu Wnt je velmi konzervovanou signalizací napříč Eukaryoty, jež reguluje mnoho buněčných procesů. Její aktivita je nezbytná zejména během vývoje jedince, ale je důležitá i v pozdější fázi života, kdy se podílí na udržení homeostáze v těle. Recentní studie ukázaly, že do regulace kanonické signální kaskády Wnt je zapojena i fosfatidylinositol-4-fosfát 5-kináza (PIP5K), která je klíčová pro tvorbu fosfatidylinositol (4,5)-bisfosfátu v buňce. U savčích buněk byl dokonce popsán model, v kterém se PIP5K účastní transdukce signálu v buňce přijímající signál Wnt. Rozhodli jsme se ověřit zapojení PIP5K v regulaci signalizace Wnt i u Caenorhabditis elegans, které je skvělým modelovým organismem pro studium signálních drah, a přispět tak k lepšímu porozumění této evolučně konzervované dráhy. V této práci jsme zjistili, že snížená exprese PPK-1/PIP5K u jedinců divokého typu nevede k chybné signalizaci Wnt. Nicméně v podmínkách, kde je již narušena aktivita dráhy Wnt, vede snížení exprese PPK-1 k defektní migraci dceřiné buňky neuroblastu QL. Analýzou migrace potomků QL, jež je kontrolována signalizací Wnt závislou na EGL-20/Wnt, jsme odhalili genetické interakce ppk-1 s některými členy této dráhy. Také jsme pozorovali vliv PPK-1 na signalizaci Wnt, která je řízena LIN-44/Wnt, jež reguluje...
|
|
|
Jaderné receptory v regulaci genové exprese, vývoje a metabolismu Caenorhabditis elegans.
Yilma, Petr ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
4 Abstrakt Genetické regulační mechanismy genové exprese podmiňují správný vývoj, funkci a odpověď na potřeby organismu ve vztahu k proměnlivým životním podmínkám. Jsou však relativně pomalé. Životní procesy vyžadující rychlou odpověď na změny prostředí a metabolismu jsou z velké části prováděny na úrovni proteinů, především jejich posttranslačních modifikací a protein-proteinových interakcí. Cílem experimetnální práce spojené s touto disertací bylo využití modelového systému Caenorhabditis elegans ke studiu regulace genové exprese transkripčními faktory ze skupiny jaderných receptorů. Modelový systém C. elegans nabízí velmi výkonné experimetnální přístupy především v oblasti genetiky, genomiky a funkční fenotypické analýzy. V práci spojené s touto disertací jsem studoval regulaci genové exprese za experimantálních podmínek z hlediska funkční proteomiky a zaměřil jsem se na využití separačních metod a metod pokročilé proteomiky, především hmotnostní spektrometrie. V první části práce jsem charakterizoval jaderný receptor NHR-60 na úrovni proteinu. Tento jaderný receptor je exprimován ve dvou proteinových formách o velikosti 50 kDa a 64 kDa, které jsou s různou intensitou detekovány v materiálu z kultur C. elegans a to přes to, že na úrovni mRNA je nhr-60 exprimován ve formě jediné mRNA odpovídající proteinu...
|
host ::
RSS.