|
|
Regulace exprese proteinů nespecifické imunity u Caenorhabditis elegans.
Kaštánková, Iva ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Cmarko, Dušan (oponent)
5 Abstrakt Lipopolysacharidy, molekuly tvořené lipidy s kovalentně navázanými sacharidy, jsou charakteristickou složkou buněčné stěny gramnegativních bakterií. Je přičinou těžkých septických stavů u člověka a tím i komplikací v humánní medicíně Lipopolysacharid je konstantní součástí infekce gramnegativních bakterií, proto předpokládáme evolučně zachovalou nespecifickou imunitní odpověď a ochrany. Otázkou je, zda existuje tato imunitní odpověď u modelového organismu Caenorhabditis elegans. Pokud ano, jakým mechanismem je řízena a regulována. Mnohobuněčnému organismu Caenorhabditis elegans jsme podali lipopolysacharid bakterie Pseudomonas aeruginosa 10 v kombinaci s bakteriemi Escherichia coli. Pozorovali jsme vliv lipopolysacharidu na expresi vybraných genů. Dále jsme sledovali metabolismus a vývoj organismu. Prokázali jsme vliv lipopolysacharidu na expresi genů z rodin C-typy lecitinů, clec-60 a clec-71, dále na lys-5, hsp-60 a F44G.3.2.1. Po inkubaci Caenorhabditis elegans na komponentách lipopolysacharidu jsme zjistili regulaci těchto vybraných genů hydrofobní lipidní složkou lipopolysacharidu, lipidem A. Překvapivě regulaci sacharidovými složkami, glukosou a galaktosou jsme neprokázali. Změnil se metabolismus lipidů. Prokázali jsme snížení neutrálních tuků a změny v zastoupení některých mastných...
|
|
|
Gene expression regulation by nuclear receptors in a specific metabolic context - evolutionary perspective
Kaššák, Filip ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent) ; Leontovyč, Ivan (oponent)
Mezi nejdůležitější regulátory genové exprese u zvířat patří jaderné receptory (NRs) a jejich koregulátory, zejména Mediátorový komplex. Zvláštní zájem vzbuzují NRs zúčastňující se na metabolické a vývojové regulaci a na karcinogenesi: receptory hormonů štítné žlázy (TRs) a retinoidové X receptory (RXRs). Ve své práci se podjímám úkolu objasnit některé aspekty regulace genové exprese těmito NRs: míru evoluční konzervace jejich signalizačních drah; mechanismy negativní regulace jadernými receptory; a možné aplikace těchto objevů v klinické medicíně. Použil jsem bioinformatické a mikroskopické metody, včetně metod genové editace, a to na třech úrovních evoluce zvířat ke studiu vtahu NRs a Mediátoru. Reversní genomická analýza u lidských pacientů trpících syndromem rezistence k thyroidním hormonům je využita k posouzení struktury a funkce subdomén TRβ. Porovnání sekvencí, vázné studie a in vivo experimenty u Trichoplax adhaerens vedly k identifikaci blízkého ortologu lidského RXR na počátku evoluce zvířat. Použitím analýzy databází, editace genomu a mikroskopie jsme identifikovali skutečný ortolog mediátorové podjednotky 28 u Caenorhabditis elegans, což poukazuje na zásadní homologii Mediátorového komplexu mezi nematody a člověkem. Analýza vztahu mezi druhy posiluje koncept konzervace regulační osy...
|
|
|
Úloha fosfatidylinositol-4-fosfát 5-kinázy PPK-1 v regulaci signální dráhy proteinu Wnt u Caenorhabditis elegans
Zavadilová, Kristýna ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Kostrouch, Zdeněk (oponent)
Signální dráha proteinu Wnt je velmi konzervovanou signalizací napříč Eukaryoty, jež reguluje mnoho buněčných procesů. Její aktivita je nezbytná zejména během vývoje jedince, ale je důležitá i v pozdější fázi života, kdy se podílí na udržení homeostáze v těle. Recentní studie ukázaly, že do regulace kanonické signální kaskády Wnt je zapojena i fosfatidylinositol-4-fosfát 5-kináza (PIP5K), která je klíčová pro tvorbu fosfatidylinositol (4,5)-bisfosfátu v buňce. U savčích buněk byl dokonce popsán model, v kterém se PIP5K účastní transdukce signálu v buňce přijímající signál Wnt. Rozhodli jsme se ověřit zapojení PIP5K v regulaci signalizace Wnt i u Caenorhabditis elegans, které je skvělým modelovým organismem pro studium signálních drah, a přispět tak k lepšímu porozumění této evolučně konzervované dráhy. V této práci jsme zjistili, že snížená exprese PPK-1/PIP5K u jedinců divokého typu nevede k chybné signalizaci Wnt. Nicméně v podmínkách, kde je již narušena aktivita dráhy Wnt, vede snížení exprese PPK-1 k defektní migraci dceřiné buňky neuroblastu QL. Analýzou migrace potomků QL, jež je kontrolována signalizací Wnt závislou na EGL-20/Wnt, jsme odhalili genetické interakce ppk-1 s některými členy této dráhy. Také jsme pozorovali vliv PPK-1 na signalizaci Wnt, která je řízena LIN-44/Wnt, jež reguluje...
|
|
|
The role of evolutionarily conserved proteins BIR-1/Survivin and SKP-1 in the regulation of gene expression
Kostrouch, David ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Dráber, Pavel (oponent) ; Pacák, Karel (oponent)
Souhrn SKIP a BIR/Survivin jsou evolučně zachovalé proteiny. SKIP je známý transkripční a sestřihový kofaktor a BIR-1/Survivin reguluje bunečné dělení, genovou expresi a vývoj. Inaktivace SKP-1 a BIR-1 indukuje podobné vývojové fenotypy. K odhalení možných interakcí SKP-1 a BIR-1 jsme použili kvasinkový dvojhybridní systém a knihovnu kompletní mRNA C. elegans. Tyto experimenty identifikovaly částečně se překrývající kategorie proteinů jako interaktory proteinů SKP-1 a BIR-1. Identifikované interagující proteiny zahrnovaly ribozomální proteiny, transkripční faktory, translační faktory, cytoskeletální a motorové proteiny. Tyto výsledky naznačují jejich možnou účast v mnohočetných proteinových komplexech. Pomocí krátkodobé nadměrné exprese BIR-1 jsme sledovali účinek BIR-1 na proteom C. elegans v larválním stádiu L1. To způsobilo dramatickou změnu v celém proteomu což naznačuje, že BIR-1 má schopnost změnit chromatografický profil mnohočetných cílových proteinů včetně těch, které jsme již dříve identifikovali jako interagující proteiny v experimentach s kvasinkovým dvouhybridním systému. Výsledky jsme následně potvrdili pro RPS-3, RPL-5, myosin (non-muscle myosin) a TAC-1 (transkripční kofaktor a protein asociovaný s centrosomy). Tyto výsledky naznačují, že SKP-1 a BIR-1 jsou multifunkční proteiny, které jsou...
|
|
|
Orphan Nuclear Receptor TLX (NR2E1) in Regulation of Cell Reproduction and Differentiation
Raška, Otakar ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Otová, Berta (oponent) ; Nedvídková, Jara (oponent)
Jaderné receptory zahrnují rozsáhlou rodinu transkripčních faktorů, které jsou silnými regulátory tkáňového metabolismu, homeostázy a vývoje tkáně živočišných druhů včetně člověka. Jsou zvláště zajímavé pro svoji schopnost reagovat na vyvázání hormonů, metabolitů, xenobiotik či uměle vytvořených molekul a převést interakci s těmito malými lipofilními molekulami do specifického regulačního signálu. Při hledání jaderných receptorů, jejichž úloha by mohla být kritická pro nervovou tkáň u bezobratlých a zachovalá během vývoje živočichů, jsme identifikovali blízký homolog TLX obratlovců u ploštěnky Schmidtea mediterranea. Ploštěnky představují velmi slibný biologický model pro studium tkáňové homeostázy a regenerace. Ploštěnky jsou schopny vstřebávat vlastní tkáně a použít je jako zdroj energie během hladovění, a pomocí neoblastů znovu vytvořit celé svoje tělo při dostatku potravy. Informatická analýza veřejně přístupných dat sekvenovacího projektu Schmidtea mediterranea ukázala, že genom planarií obsahuje minimálně jeden gen s vysokým stupněm podobnosti s genem tlx obratlovců. Klonovali jsme kompletní CDS (coding DNA sequence of cDNA) a charakterizovali jsme gen funkčně. Ukázali jsme, že TLX (NR2E1) vykazuje u ploštěnky a obratlovců vysokou podobnost v jejich celé délce kódující...
|
|
|
Jaderné receptory v regulaci genové exprese, vývoje a metabolismu Caenorhabditis elegans.
Yilma, Petr ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
4 Abstrakt Genetické regulační mechanismy genové exprese podmiňují správný vývoj, funkci a odpověď na potřeby organismu ve vztahu k proměnlivým životním podmínkám. Jsou však relativně pomalé. Životní procesy vyžadující rychlou odpověď na změny prostředí a metabolismu jsou z velké části prováděny na úrovni proteinů, především jejich posttranslačních modifikací a protein-proteinových interakcí. Cílem experimetnální práce spojené s touto disertací bylo využití modelového systému Caenorhabditis elegans ke studiu regulace genové exprese transkripčními faktory ze skupiny jaderných receptorů. Modelový systém C. elegans nabízí velmi výkonné experimetnální přístupy především v oblasti genetiky, genomiky a funkční fenotypické analýzy. V práci spojené s touto disertací jsem studoval regulaci genové exprese za experimantálních podmínek z hlediska funkční proteomiky a zaměřil jsem se na využití separačních metod a metod pokročilé proteomiky, především hmotnostní spektrometrie. V první části práce jsem charakterizoval jaderný receptor NHR-60 na úrovni proteinu. Tento jaderný receptor je exprimován ve dvou proteinových formách o velikosti 50 kDa a 64 kDa, které jsou s různou intensitou detekovány v materiálu z kultur C. elegans a to přes to, že na úrovni mRNA je nhr-60 exprimován ve formě jediné mRNA odpovídající proteinu...
|
|
|
Evolutionarily conserved mechanisms of gene expression regulation by nuclear receptors.
Chughtai, Ahmed Ali ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Malínský, Jan (oponent) ; Brábek, Jan (oponent)
Transkripční regulace genové exprese eukaryotních organismů se vyvinula během milionů let. Regulační cesta jaderných receptorů představuje evolučně starý, ale zachovalý mechanismus zahrnující asociované akcesorní proteiny, z nichž mnohé tvoří funkční strukturu známou jako Mediátorový komplex, který je účastný v transkripci. Hypotézujeme, že přes universalitu této cesty, v níž vnitřní potenciál NR-Mediátorové cesty zachovalý napříč druhy, přímo překládá regulační signál do biologické odpovědi zapojením nových adaptačních funkcí ve fylogeneticky novějších Metazoidních organizmech a přídavná regulace může být dosažena sekundárními funkcemi základních členů této regulace. Pro podporu této hypotézy jsme studovali schopnost vazby ligandu retinoidního X receptoru ve vločkovci Trichoplax adhaerens a přinesli důkaz podporující koncept, že tato schopnost byla přítomna již na počátku metazoidní evoluce. S ohledem na možné sekundární funkce, majíce inspiraci z našeho předcházejícího výzkumu, jsme identifikovali Mediátorovou podjednotku 28 (MED28) jako jediný známý člen s dokumentovanou duální cytoplasmatickou a jadernou funkcí a mající tedy potenciál přenášet signály z jaderných strukturních stavů do jádra. V důsledku chybění významné zachovalosti sekvence, ale dostupnosti experimentálních přístupů, jsme se...
|
|
|
Regulation of gene expression at posttranscriptional levels.
Kollárová, Johana ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent) ; Jindra, Marek (oponent)
Regulace genové exprese v odpovědi na potřeby buněk a organismů je zásadní pro přežití organismů a úspěšnou kompetici v evoluci forem života. Tato regulace je prováděna na mnohočetných úrovních počínaje genovou transkripcí, následovanou regulacemi na četných posttrankripčních úrovních. V této disertační práci jsem se zaměřila na posttrankripční mechanismy, které přispívají k regulaci genové exprese v modelovém organismu Caenorhabditis elegans, který umožňuje efektivní genetické a genomické přístupy a vizualizaci důsledků experimentálních manipulací in toto, na úrovni celého organismu v jeho kompletním životním cyklu. Pro dosažení tohoto cíle jsme analyzovali funkci proteinu GEI-8, ortologu transkripčního korepresoru NCOR. Použili jsme funkčně defektivní mutantu gei- 8(ok1671). Analyzovala jsem celogenomovou expresi homozygotní mutanty gei-8(ok1671) a její vztah k pozorovanému fenotypu zahrnujícímu defektivní vývoj gonády a sterilitu. Provedli jsme experimenty, které podporují regulační zapojení 21U-RNA třídy piRNA exprimovaných z de-reprimovaného genu Y9C9A.16, kodujícího předpovězenou mitochondrialní sulfide:quinine reduktázu, ve vývoji gonadálního fenotypu. V druhé části disertační práce jsem se soustředila na funkci RNA modifikujícího enzymu ALKB-8, orthologního k ALKBH8 obratlovců, který je...
|
|
|
Conserved Mechanisms of Gene Expression Regulation by Nuclear Receptors.
Novotný, Jan Philipp ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Stopka, Pavel (oponent) ; Lazar, Jozef (oponent)
8 Abstrakt Od samého počátku života na planetě Zemi se organismy, k tomu, aby přežily, musely adaptovat měnícím se podmínkám prostředí. S výskytem metazoické mnohobuněčnosti se skupiny buněk mohly adaptovat k tomu, aby vykonávaly specifickou biologickou funkci, ze které těží celý organismus. To vyžadovalo nejen časoprostorovou regulaci exprese genů během vývoje, ale i integraci specifických požadavků tkání s celkovým stavem organismu. V rámci souboru vývojově zachovaných regulačních systémů vy- čnívá rodina transkripčních faktorů jaderných receptorů (NR). Důvodem je její vysoký stupeň evoluční konzervace, plasticita a jedinečnost ve vztahu k živočišné říši a účast při regulaci exprese genů v odezvě na ligand, či jeho nepřítomnost, genomovými a negenomovými mechanismy. Se zvyšujícím se počtem molekul, které jsou považovány za ligandy těchto receptorů, se dnes předpokládá, že původní receptory byly pravděpo- dobně charakterizovány nízkou specifičností vazby ligandu a eventuálně sloužily jako environmentální senzory, které integrovaly dostupnost živin a expresi genů na samém začátku evoluce Metazoa. Charakteristika sítě NR v jednom z nejjednodušších metazo- ických organismů, Trichoplax adhaerens, odhalila nejen funkční síť a sub-specializaci genové regulace závisející na NR, ale i výjimečnou citlivost na 9-cis...
|
|
|
Jaderná architektura a genová exprese u Caenorhabditis elegans
Bolková, Jitka ; Lanctôt, Christian (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent) ; Kostrouch, Zdeněk (oponent)
Jaderná architektura a genová exprese u Caenorhabditis elegans Mgr. Jitka Bolková ABSTRAKT Po oplození jsou rodičovské genomy nejprve separovány každý ve svém prvojádře. Již v první mitóze se toto prostorové rozlišení ztrácí. Ve své práci jsme využili fotokonverzi prvojader značených Dendra2-H2B k rozpoznání maternálních a paternálních chromatinových domén a pozorovali jejich prostorové rozdělení v živých embryích Caenorhabditis elegans krátce po oplození. Oba rodičovské chromatiny jsou v zygotě i v celém dvoubuněčném stádiu v rámci jádra stále odděleny. K promíchání dochází teprve po dekondenzaci chromatinu na začátku buněčného cyklu čtyřbuněčného embrya. Dle našich znalostí se jedná o první živé pozorování separace a následného promísení parentálních chromatinových domén během embryogeneze. Následování fotokonvertovaného chromatinu nám dále umožnilo detekovat reprodukovatelnou rotaci jader o 180ř v průběhu cytokineze zygoty. Sledování fluorescenčně značených P granulí a pólových tělísek odhalilo, že dochází k rotaci celého embrya. Ve druhé části disertace jsme využili modelu C. elegans pro výzkum souvislostí mezi jadernou architekturou a genovou expresí. Zaměřili jsme se na lokalizaci transkripční aktivity v zárodečných buňkách gonády. Pomocí metod umožňujících detekci nascentní transkripce, single...
|
host ::
RSS.