|
| |
|
|
Genome editing using programmable endonucleases
Hanečková, Radmila ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Sýkora, Michal (oponent)
Programovatelné endonukleázy jsou proteiny schopné rozpoznat specifické sekvence nukleotidů a následně v rozpoznané sekvenci štěpit obě vlákna DNA. Zinc-finger nukleázy jsou široce využívaným nástrojem v genomové editaci, metodě zavádění změn do genomů buněčných liní nebo celých organismů za účelem studia funkce genů. Nedávno se objevily nové typy programovatelných endonukleáz v podobě transcription activator-like effector (TALE) nukleáz a CRISPR/Cas systému. Tyto systémy se od sebe liší z pohledu mechanizmu funkce, dostupnosti, selektivity, frekvence off- targetů a cytotoxicity. V této práci zinc-finger nukleázy, TALE nukleázy a CRISPR/Cas systém porovnáváme a zkoumáme jejich aktuální a možné budoucí využití v široké oblasti výzkumu, který sahá od vývoje geneticky modifikovaných organismů až po genovou terapii. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
The role of tissue specific isoforms of subunit 4 in assembly and function of cytochrome c oxidase
Čunátová, Kristýna ; Pecina, Petr (vedoucí práce) ; Stibůrek, Lukáš (oponent)
Systém oxidační fosforylace (OXPHOS) je zodpovědný za produkci naprosté většiny ATP v savčích organismech. Tento proces, lokalizovaný ve vnitřní mitochondriální membráně, je mimo jiné regulován jaderně kódovanými podjednotkami cytochrom c oxidázy (COX), která je terminálním enzymem elektron transportního řetězce. Podjednotka Cox4 se účastní regulace OXPHOS systému a spolu s podjednotkou Cox1 utváří první intermediát v sestavování COX. Není-li tento intermediát správně sestaven, nedojde následně ke vložení Cox2 katalytické podjednotky a tím k maturaci katalyticky funkčního COX enzymu. Mimo to je Cox4 podjednotka přítomna ve dvou izoformách (Cox4i1, Cox4i2), které hypoteticky slouží k optimalizaci funkce respiračního řetězce během změn v zásobování tkání kyslíkem. Funkční dopad výměny izoforem nebyl nicméně doposud v savčích tkáních a buňkách podrobně prozkoumán. V rámci této práce byly pomocí CRISPR CAS9-10A párující nikázy připraveny jedinečné modely HEK293 buněk s úplnou absencí (knock-out, KO) podjednotky Cox4, a byly dále charakterizovány. Vyřazení funkce obou izoforem Cox4i1 a Cox4i2 (COX4i1/4i2 KO klony) vedlo ke generalizovanému snížení COX podjednotek spojenému s úplnou absencí sestavené COX. Množství detekovaných podjednotek komplexu I, stejně jako obsah sestaveného komplexu I, byly sníženy...
|
|
|
Nanočástice pro přenos genové terapie
Dvořáková, Nikola ; Ellederová, Zdeňka (vedoucí práce) ; Šálek, Petr (oponent)
Genová editace pomocí CRISPR/Cas9 systému je jedna z možností, která udává nový směr v rozvoji genové terapie. Nejčastěji využívaným prostředkem pro přenos DNA do buněk jsou viry, které však nedokáží často pojmout CRISPR/Cas9 systém, velký až několik kb. Nanočástice (NPs) jako nevirové přenašeče se jeví jako možný prostředek, jak tento systém do buňky přenést. Pro tuto práci byly vybrány magnetické Fe3O4 NPs (MNPs) kvůli jejich skvělým vlastnostem jako je multifunkčnost, biokompatibilita, snadná odbouratelnost a jednoduchá syntéza. Cílem práce bylo vytvořit MNPs a komplex MNPs obalených PEI/CRISPR-Cas9 plazmidem a následně je charakterizovat pomocí fyzikálně chemických metod. Vytvořenému komplexu MNPs/PEI/CRISPR-Cas9 byly definovány přesné parametry, které byly určeny jako vhodné pro možné pohlcení buňkou. Byla ověřena také hypotéza stabilizace komplexu MNPs/CRISPR-Cas9 plazmidu po přidání polyethyleniminu (PEI), který dokáže taktéž plazmidovou DNA ochránit i před restrikčními endonukleázami. Následně mohla být komplexem MNPs/PEI/CRISPR-Cas9 transfekována stabilní modifikovaná buněčná linie HEK293-TLR3, určená pro možné pozorování oprav dvouřetězcových zlomů (DSB) pomocí nehomologního připojení konců (NHEJ) nebo homologní rekombinace (HR). Výsledky ukazují efektivitu transfekce 13 % a pro NHEJ 5 %...
|
|
|
CRISPR/Cas9-based genome editing in mice: state of the art and future perspectives
Eliáš, Jan ; Kašpárek, Petr (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Mutantní myši jsou klíčové pro odhalení funkce genů in vivo. V posledních letech prošla jejich příprava revolucí díky rychlému rozvoji programovatelných nukleáz, především systému CRISPR/Cas9. Editace genomu založená na vnesení komponentů systému CRISPR/Cas9 do časných vývojových stádií myších embryí umožnila rychlou a levnou přípravu genově deficientních myších modelů, hlavně ve srovnání s tradičními metodami, založenými na modifikacích embryonálních kmenových buněk (ESCs). Schopnost systému CRISPR/Cas9 indukovat na daném místě v genomické DNA dvojvláknový zlom (DSB) umožňuje efektivní narušení správného fungování daného genu díky náhodným mutacím dané sekvence, nebo kompletním vyštěpením daného genu. Přesné modifikace, jako inkorporace fragmentu DNA do daného lokusu, nicméně pořád zůstávají obtížně proveditelné. V této práci shrnuji systém CRISPR/Cas9, jeho použití v produkci mutantních myší a jeho možné modifikace, které by vedly ke zvýšení účinnosti přesných modifikací. Klíčová slova: CRISPR/Cas9, myš, transgeneze, homologní rekombinace
|
|
|
Transdiferenciace somatických buněk do hepatocytů a klinicky relevatní editace genu Tight junction protein 2
Fryntová, Lucie ; Janečková, Lucie (vedoucí práce) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Transdiferenciace v buňce indukuje strukturní přestavby chromatinu a epigenetické změny, které ovlivňují spektrum genové exprese a způsobují celkovou remodelaci buňky. Během transdiferenciace dochází k přímé konverzi určité zralé linie somatických buněk na zralou buněčnou linii jiného typu, napříč jednotlivými zárodečnými vrstvami. Diplomová práce byla zaměřena na transdiferenciaci mezenchymálních buněk - myších embryonálních fibroblastů na endodermální buňky - hepatocyty in vitro s použitím kombinace transkripčních faktorů Hnf4α a Foxa1. Mapování přeměny fibroblastů bylo zahájeno bezprostředně po vyvolání konverze a definitivní vznik tkáňové kultury indukovaných hepatocytů byl potvrzen morfologickými a funkčními testy. Myší indukované hepatocyty nasledně sloužily pro modelaci lidského jaterního onemocnění, ilustrujícího anamnézu pacienta z Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze, u kterého nebyla možná imunohistochemická detekce proteinu z jater. Pro genetickou editaci indukovaných hepatocytů byla použita technologie CRIPSR/Cas9, při které byl nukleázou Cas9 a navigující gRNA (guide RNA) vytvořen dvouvláknový zlom v genu Tight junction proteinu 2, a následnou syntézou komplementárního řetězce podle DNA templátu byla vyvolána bodová mutace, měnící triplet aminokyseliny v cílovém...
|
|
|
Tissue-specific knockout of starch synthesis in columella cells of Arabidopsis thaliana and gravitropic response
Bogdan, Michal ; Fendrych, Matyáš (vedoucí práce) ; Retzer, Katarzyna (oponent)
Od studií gravitropismu rostlin Charlesem Darwinem je identita specifických senzorů gravitace v rostlinách nejistá. K dnešnímu dni jsou statolity - škrobové granule v kořenových čepičkách - považovány za klíčové při percepci gravitace. Úloha statolitů jako organel zprostředkujících schopnost vnímat gravitaci v kořenech rostlin je obecně založena na výzkumech, jejichž subjekty mají vážně narušenou schopnost syntetizovat škrob nebo mají buňky obsahující statolity odstraněny či poškozené. To představuje metodické nedokonalosti, které vedou k alternativním vysvětlením, jako je narušený tok auxinu v důsledku těžkého poškození kořenové čepičky nebo neznámé zapojení škrobu z jiných částí rostliny do vnímání gravitace. Díky pokroku v oblasti technologie CRISPR/Cas9 jsme nyní schopni vytvářet tkáňově specifické mutanty, které by mohly pomoci s objasněním, zdali se škrobová zrna v kořenové čepičce podílejí na vnímání gravitace, a pokud ano, jak významné je toto jejich zapojení. Tato diplomová práce se pokusila na tyto otázky odpovědět adaptací tkáňově specifického systému CRISPR/Cas9 a jeho využitím pro tvorbu mutantů, které jsou specificky v kolumele bez škrobu. Pomocí tohoto přístupu jsme vytvořili jednu obecnou mutantní linii a tři tkáňově specifické mutantní linie, z nichž dvě mají cíle v genech...
|
|
|
Dynamics of de novo DNA methylation and its impact on transgene expression and CRISPR/Cas9 mutagenesis
Přibylová, Adéla ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Pečinka, Aleš (oponent) ; Fajkus, Jiří (oponent)
Genetická informace musí být chráněna, udržována a kopírována z mateřské buňky do buněk dceřiných, z generace na generaci. Většina rostlinných buněk obsahuje kompletní genetickou informaci a z mnoha těchto buněk může regenerovat celá nová rostlina. Takováto vlastnost vyžaduje precizní kontrolu, které geny budou aktivní a které ne, jelikož během růstu a diferenciace je potřeba aktivity pouze specifických genů v rámci jednotlivých buněk, tkání a orgánů. Jeden z mechanismů kontrolujících aktivitu genů je RNA interference (RNAi), která specificky snižuje nebo blokuje expresi genů na transkripční nebo post-transkripční úrovni. Klíčovou částí RNAi je navádění RNAi aparátu do cílové oblasti. To je zprostředkováno sekvenční komplementaritou mezi cílovou oblastí a malou RNA (sRNA), která je vyštěpena z dvouvláknového RNA (dsRNA) prekurzoru. Molekulární mechanismus tvorby dsRNA a sRNA a také původ cílové oblasti předurčuje následnou umlčující dráhu. Při transkripčním genovém umlčení (TGS) je genová exprese regulována přes epigenetické modifikace chromatinu. Jednou z epigenetických značek je metylace cytosinu, která je ustanovována především dráhou RNA-dependentní DNA-metylace (RdDM). Ačkoli byl proteinový aparát relativně dobře popsán, o dynamice klíčové počáteční fáze tohoto procesu bylo známo jen málo. Proto jsme...
|
|
|
Checkpoint blockade in cancer immunotherapy
Vacková, Julie ; Šmahel, Michal (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Říhová, Blanka (oponent)
Blokování kontrolních bodů imunitních reakcí je novým terapeutickým přístupem v léčbě nádorů, který značně zvýšil účinnost léčby různých typů nádorů. Avšak podíl pacientů s nádory neodpovídajících na tuto léčbu je vysoký. Zavedení predikčních znaků pro rozlišení pacientů vhodných pro léčbu blokováním kontrolních bodů by mohlo zvýšit počet pacientů, kteří by měli z této léčby užitek. Tato disertační práce je zaměřena na zvýšení účinnosti inhibitorů kontrolních bodů imunitních reakcí (ICIs) a na predikční znaky s využitím experimentálních modelů myších nádorů vyvolaných buněčnými liniemi TC-1 a TC- 1/A9 a jejich klony s deaktivací signalizace interferonu (IFN)-γ (TC-1/dIfngr1 a TC- 1/A9/dIfngr1) nebo molekuly CD80 (TC-1/dCD80-1). IFN-γ je považován za hlavní cytokin zvyšující expresi ligandu programované buněčné smrti 1 (PD-L1) a hlavního histokompatibilního komplexu I (MHC-I). Exprese PD-L1 může předpovídat citlivost k blokování PD-1/PD-L1. Nefunkční signalizace IFN-γ nebo snížená exprese MHC-I u některých pacientů souvisela s rezistencí k ICIs. Zjistili jsme, že IFN I. typu (IFN-α a IFN-β) zvyšují expresi PD-L1 a MHC-I na nádorových buňkách TC-1/A9/dIfngr1 s reverzibilně sníženou expresí obou molekul. Také jsme ukázali, že deaktivace signalizace IFN-γ v buňkách TC-1/A9 nebyla kontraindikací pro...
|
|
|
Generation and analysis of mutant mouse model to study roles of KLKs in cutaneous inflammation
Eliáš, Jan ; Kašpárek, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Kallikreinové peptidázy (KLKs) jsou podskupinou serinových proteáz se zásadní důležitostí pro řadu funkcí, jejichž dysregulace přispívá k řadě patologických fenotypů. Nethertonův syndrom zaujímá mezi těmito patologiemi zásadní postavení, jelikož deregulace kallikreinových proteáz hraje klíčovou roli, především KLK5, KLK7 a do menší miry také KLK14. V případě této patologie je narušen gen hlavního regulačního proteinu těchto proteáz v kůži, kterým je SPINK5. To vede k nekontrolované hyprreaktivitě těchto proteáz a následnému narušení epidermální bariéry díky nadměrné epidermální deskvamaci a vážnému zánětu kůže. Zánětlivé mechanismy Nethertonova syndromu jsou v tuto chvíli relativně málo objasněné a panuje přesvědčení, že hlavní roli hraje zpracování imunitních molekul pomocí těchto proteáz a dysregulace kožního mikrobiomu. TNFα signalizace hraje klíčovou roli v imunitní odpovědi proti mikrobům a chronické kožní záněty mohou vest k závažným zdravotním stavům, ve kterých je TNFα důležitým komponentem. Abychom adresovali vliv TNFα signalizace v kontextu kallikreinových proteáz a Nethertonova syndromu, tak jsme vytvořili myší model, ve kterém je narušen gen Tnfr1 kódující protein receptor TNFR1 na pozadí již vytvořených modelů Nethertonova syndromu. Úspěšně jsme vytvořili Tnfr1-/- myší model a následně...
|
host ::
RSS.